SN_T 3400-2012松材线虫实时荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3400—2012松材线虫实时荧光PCR检测方法Detection of Bursaphelenchus xylophiluswith real-timefluorescent polymerase chain reaction2013-07-01实施2012-12-12发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3400—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郭立新、段维军、顾建锋、闻伟刚、陈先锋、郑炜、王江岭 SN/T3400—2012引言本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到5.13与“-种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针”相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得；专利持有人姓名：刘杏忠曹爱新朱水芳地址：100080北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。I SN/T3400—2012松材线虫实时荧光PCR检测方法范围1本标准规定了松材线虫的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1132-2002松材线虫检疫鉴定方法SN/T1724-2006进境针叶树原木、木制品和禾质包装材料中松材线虫的检疫操作规程3原理3.1松材线虫学名及分类地位中文名称：松材线虫Buhrer,1934)Nickle,1970学名：Bursaphelenchusylopkilus(Ste英文名：Pinewoodnematod缩写：PWN分类地位：线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernelehtea）、滑刃目（Aphelenchida）、滑刃科（Aphelen滑刃线虫属（BursphelenchusFuchs)。choididae）、伞滑刃亚科（Bursap)3.2实时荧光PCR检测依据样品经过提取DNA后，针对核糖体DNA内转录间隔区（ITS区）设计引物和探针，通过实时荧光PCR技术，特异性扩增目的片断，根据实时荧光PCR扩增曲线，判断该样品中是否有松材线虫。抽样和取样4抽样和取样见SN/T1724。5试剂和溶液除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。5.1溶解缓冲液(200mmol/LNaCl200mmol/LTris-HCl,pH8.0;100mmol/LEDTApH8.0;2%SDS；2%β-巯基乙醇）。5.220mg/mL蛋白酶K。5.3Tris饱和酚。 SN/T3400--20125.4酚：三氯甲烷：异戊醇（体积比：25：24：1)。5.5三氯甲烷：异戊醇（体积比：24：1)。5.63mol/L乙酸钠（pH4.6)。5.7无冰乙醇。5.870%乙醇。5.9线虫裂解液（125mmol/LKCl;25mmol/LTris-HCl,pH8.3;3.75mmol/I.MgCl2;2.5mmol/LDTT;1.125% Tween-20)。5.10dVTPs:含 dATP,dCTP,dGTP,dTTP。5.11氯化镁（MgCl2）。5.122TagDNApolymerase及其缓冲液。5.13号引物和探针：见表1。表1引物和探针序列引物和探针序列正向引物Pf5-GAT GAT GCG ATT GGT GAC T-3反向引物Pr5-AAC GAC GCG AAT CGA ACC-3探针Probe5-CGG TTG CCG CGC ATG ATG G-3注：探针5端含有FAM报告荧光染料，3端含有TAMRA淬灭荧光染料。6仪器和材料6.1仪器电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（-·80℃）、制冰机、加热混合器、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、实时荧光PCR仪、微量可调移液器：2μL、20μL、200μL、1000μL、5000μL。6.2材料吸头：10uL、20μL、200uL、1000μul、5000uL。离