SN_T 3483-2013松江鲈鱼的物种鉴定方法 PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3483—2013松江鲈鱼的物种鉴定方法PCR 方法Identification protocol for Trachidermus fasciatus --PCR2013-09-16实施2013-03-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局副涂层意真伪 SN/T3483—2013言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：徐彪、赵玉然、岳志芹、张太翔、郑小龙、赵巍。 SN/T3483—2013松江鲈鱼的物种鉴定方法PCR方法1范围本标准规定了松江鲈鱼物种鉴定PCR方法的技术规范。本标准适用于松江鲈鱼的种质鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1Ct值cyclethreshold荧光信号由本底进入指数增长期时拐点所对应的实时荧光定量PCR循环次数。3.2扩增曲线amplificationcurve在实时荧光定量PCR反应中，模板被扩增，实时荧光定量PCR产物经过线性增长期、指数增长期以及平台期三个阶段，实时荧光定量PCR产物的量随时间的变化而得到的曲线。4技术原理本实验是利用松江鲈鱼细胞色素b(Cytochromeb，Cytb)基因的保守性与特异性设计引物与探针，建立实时荧光定量PCR方法。该方法是在常规PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；实时荧光定量PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。该方法具有实时、定量、特异性强、灵敏度高的优点。5试剂和材料5.1实验用水应符合GB/T6682的规定。1 SN/T3483—20135.2酶反应预混液包含热启动酶（95℃，10min启动）、dNTP、Mg²+和优化的反应缓冲液。5.3实时荧光定量PCR引物正向引物：5-AGCCTTCTCATCAGTCGGACAT-3”反向引物：5-CGTGAAGGTTCCGGATGAGT-3”探针:5-FAM-TCTGCCGGGACGTCAACTACGGA-TAMRA-3引物与探针经稀释后，浓度为10umol/L，一20℃保存备用。引物扩增片段为位于松江鲈鱼-Gyt-br基因士的段核苷酸序。松江鲈鱼Cytb基因序列参见附录A。6仪器和设备6.1组织研磨器（0r/min~20000r/min6.2实时荧光定量PCR仪。6.3核酸分析仪。7松江鲈鱼种质鉴定的方法7. 1样品的处理松江鲈鱼形态学参见附录B。肌肉组织/经研腐后置于℃冰箱中备用。7.2DNA的提取样品DNA的提取可采用动物纠织基因组随川试剂盒按说明书撑取，也可采用常规抽提法.见附录C。7.3样品DNA含量用核酸分析仪测定样品的OD：根据1OD=5oμg/L，计样品DNA含量。7.4实时荧光定量PCR扩增7.4.1实时荧光定量PCR反应体系12.5μL2×酶反应预混液（TaqmanUniversalPCRMasterMix），10umol/L正、反向引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，待检样品DNA（10ng/μl~100ng/μl)1μl.用H.O补充至25μl。每个样品各做2个平行。7.4.2实时荧光定量PCR反应条件50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；40个循环。7.4.3阳性对照、空白对照的设立在实时荧光定量PCR检测过程中，分别以松江鲈鱼核酸、水作为阳性对照、空白对照的模板。实时荧光定量PCR反应过程中仪器自动收集荧光信号，反应结束后，查看扩增曲线、Ct值。2 SN/T 348320138结果判断阳性样品的实时荧光定量PCR扩增呈“S型扩增曲线，空白对照没有扩增曲线。通过阳性对照、空白对照的扩增结果排除假阳性结果。在阳性对照、空白对照成立的前提下，检测样品的结果根据其Ct值和扩增曲线综合判定：若Ct值35，且扩增曲线呈“S型，则判为阳性，该样品判断为松江鲈鱼；a）b）若35Ct40，应重做实时荧光定量PCR扩增，再次扩增后的结果仍Ct40，且阳性对照、空白对照结果正常，则可判定样品检测结果为阳性，该样品判断为松江鲈鱼，再扩增后结果Ct≥4