SN 1488-2004兔病毒性出血症血凝抑制试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1488—2004免病毒性出血症血凝抑制试验操作规程Protocol of haemagglutination-inhibition test forviral haemorrhagic disease of rabbit2005-04-01实施2004-11-17 发布中华人民共和国发布效码防衡“国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1488—2004前 言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由中华人民共和国认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标推主要起草人：王水明、彭钰欣、朱雪良、刘学辉。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 SN/T 1488-2004兔病毒性出血症血凝抑制试验操作规程1范围本标准规定了兔病毒性出血症血凝抑制试验操作规程。本标准适用于检测兔体中兔病毒性出血症病毒和血清中的兔病毒性出血症抗体。2原理兔病毒性出血症病毒能使人的O型红细胞发生凝集，而对其他动物的红细胞不发生凝集或凝集不明显；兔病毒性出血症病毒感染兔后，兔体会产生特异性抗体。这种抗体和兔病毒性出血症病毒反应后,能够抑制病毒对人的O型红细胞的凝集。3材料和试剂3.1仪器普通天平、分析天平、普通离心机、96孔V型血凝板、25μL可调移液器、恒温箱、微型振荡器等。3.2可疑兔及正常兔肝悬液的制备分别将肝脏剪碎，按1：10加人生理盐水后勾浆，再以4000 r/min离心30min，取上清液做血凝试验。3.3生理盐水配制0.85%浓度的生理盐水。3.4阿氏液(AIsevers)配制见附录A。3.51%人“0”型红细胞悬液的制备取新鲜的人“O型红细胞于阿氏液中（置4℃可保存一周）。用时取人“O”型红细胞以20倍量生理盐水混匀洗涤红细胞，2000r/min离心15min，弃上清，重复洗涤四次，洗涤后的红细胞用生理盐水配成1%红细胞悬液置4℃备用，在72h内用完。3.6抗原、阳性血清由指定单位供应，按说明书使用。3.7被检血清的处理按常规无菌采取血样，分离血清，并对血清做56℃、30min灭活处理。4操作方法4. 1α-微量血凝抑制试验4.1.1 实验步骤每个样品作相同的2排，从第1孔开始到第11孔每孔加生理盐水25μL第1、2孔加可疑兔肝组织悬液25μL。从第2孔开始，用25μL移液管作等量倍比稀释至第10孔，最后1孔弃去25μL(其病毒稀释度则为10、20、40、80····.等）。第12孔为正常兔肝悬液对照。第2排每孔加阳性血清25μL，于微型振荡器上摇匀，37℃温箱放置10min。每孔加入1%人0”型红细胞25μL，立即在微型振荡器上摇匀，置4℃冰箱作用45min，待对1 SN/T 1488—2004照孔红细胞完全沉积后观察结果。4.1.2红细胞凝集效价表示方法和结果判定红细胞凝集效价表示方法：++++为100%凝集，无红细胞沉积；+十+为75%以上凝集,有少于25%的红细胞沉积；十十为50%～75%凝集,有少于50%的红细胞沉积；十为少于50%凝集，有多于50%的红细胞沉积；(一)为 100%的红细胞沉积。结果判定检查各种对照。正常兔肝悬液(阴性对照)应该出现红细胞完全沉积，而生理盐水对照红细胞也应完全沉积。第1排微量血凝试验和第2排微量血凝抑制试验两排孔的血凝效价相差2个滴度以上（含2 个滴度)为阳性。4. 2 β微量血凝抑制试验4.2.1 实验步骤在96孔V型微量滴定板上的第2～11孔加人生理盐水25μL，然后在第1、2、12孔加人1：5稀释的待检血清25μL，从第2孔开始，用移液器作倍比稀释至第9孔，最后1滴稀释液弃去。在第1～10孔，每孔加4个凝集单位的抗原25μL,第11～12孔加生理盐水25μL，摇勾，37℃温箱作用10min，第10孔是4个血凝单位对照,第11孔是生理盐水对照,第12孔为血清对照。每孔加人1%人0”型细胞25μL，立即在微型混合器上摇匀，置37℃温箱45min，待对照孔的细胞沉降后观察结果。4.2.2结果判定结果观察和记录同血凝试验，以出现完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度为该被检血清的血凝抑制价。 SN/T 1488---2004附录A(规范性附录)阿氏液的配制阿氏液（红细胞保存液）葡萄糖2.05 g氯化钠0.42 g0.80 g枸橼酸钠(NagC。H,O,· 2H,O)0. 055 g构橼酸(H.C.H,O, · H,O)蒸馏水加至 100 mL将以上试剂混合加热溶解、过滤，分装，68.94kPa15min灭菌，4℃保存。 +00288L/NS中华人民共和国出人境检验检疫行业标准免病毒性出血症血凝抑制试验操作规程SN/T 1488—2004*中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045