SN_T 5133-2019枣大球蚧及近似种DNA条形码鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5133--2019枣大球及近似种DNA条形码鉴定方法DNA barcoding for Eulecanium gigantea and related species2019-09-03发布2020-03-01实施中中国海国出版社有限公司中华人民共和国海关总署发布HG944440024223活网刮开涤反激活密码 SN/T 5133--2019前言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国太原海关、中华人民共和国运城海关、山西省运城市盐湖区植物保护检疫站。本标准主要起草人：李惠萍、刘晓琳、刘艳俊、高媛惠、杨营业、王琳、毛本前、高浩、刘海峰。 SN/T 5133--2019枣大球及近似种DNA条形码鉴定方法范围本标准规定了枣大球及近似种 DNA 条形码鉴定方法。本标准适用于枣大球及近似种基因组的提取、DNA 条形码序列的扩增、序列核查比对及基于DNA 条形码的种类鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA 条形码 DNA barcodes生物体内一段较短的、标准的、有足够变异的且易扩增的基因片段,在昆虫中，一般是指线粒体COI基因上5端的一段序列。3.2COI 基因 Cytochrome C Oxidase I gene线粒体基因组的细胞色素 C氧化酶亚基1的编码基因，该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。3.3DNA barcodingDNA 条形码鉴定通过对DNA 条形码基因片段的扩增和序列比对,进行生物物种的区分和鉴定。3.4序列相似性: similarity of the sequences反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。缩略语4下列缩略语适用于本文件。COI：线粒体细胞色素 C氧化酶亚基 I,Cytochrome C Oxidase I。CTAB:十六烷基三甲基溴化铵,Cetyltrithylammonium bromide。5枣大球及近似种的基本信息中文名：枣大球 SN/T 5133--2019学名:Eulecanium gigantea英文名:Gigantic globular scale近似种：皱大球蚜 Eulecanium kuwanai、朝鲜毛球 Didesmococcus koreanus、沙里院褐球蚜Rhodococcus sariuoni、水木坚蜥 Parthenolecanium corni 。分类地位:枣大球蚜属半翅目 Hemiptera,科 Coccidae,大球属 Eulecanium Cockerell。枣大球与皱大球蚜E.kuwanai、朝鲜毛球D.koreanus、沙里院褐球R.sariuoni、水木坚P.corni在形态上相似,难以区分，这类虫多分布于温带地区，主要危害经济林木、绿化植物、景观花卉等，通过吸食植物汁液，分泌蜜露，导致植物生长衰弱和枯死。枣大球与近似种均固定在寄主植物上带来危害，可随寄主作远距离传播。6　方法原理利用一对特定引物对球类虫线粒体 DNA中的 C(OI 基因片段进行扩增和测序,获得长度约为750 bp 的 DNA序列,对该序列进行核查、校对和处理后得到有效序列,跟 NCBI数据库中相应的序列进行比对,根据序列的相似度实现物种确定的目的。7仪器、试剂及耗材7.1 仪器常规PCR仪、核酸蛋白分析仪、电泳仪、凝胶成像系统、生物安全柜、高压灭菌锅、显微镜、电子天平（感量1/10000）、眼科手术剪（10cm直尖头）、水浴锅、恒温磁力搅拌器、旋涡混合仪、制冰机、纯水仪、干燥箱、冰箱、离心机(最大离心力大于14 000 g）、微量移液器（0.5 μL，2μL，10μL,20 μL,100 μL，200 μL,1 000 μL)。7.2试剂、耗材7.2.1 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。CTAB提取液（配制方法见附录A）、超纯水（应符合GB/T6682的规定）、无水乙醇、Tris饱和酚、TE缓冲液、蛋白酶K、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、DNA聚合酶、dNTP、6× DNA 上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖、溴化乙锭(EB)、TAE电泳液、胶回收试剂盒。7.2.2耗材PCR 管(0.2 mL,1.5 mL)、无粉-一次性手套。7.3引物见表1。2 SN/T 5133—2019表1引物和引物序列扩增片段