SN_T 3971-2014小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3971-2014小反色兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法Immunochromatographic assay of colloidal gold for detection of peste des petitsruminants2015-03-01实施2014-07-14 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、刮涂层登真伪 SN/T 3971—2014前言本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国西藏出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨俊兴、刘忠清、杨云庆、赤列加措、花群义、吕建强、祝贺、孙洁、艾军、唐金明。I SN/T 3971—2014小反鱼兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法1范围本标准规定了小反乌兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法。本标准适用于小反台兽疫抗体的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。BSA：牛血清白蛋白ICS:免疫层析试纸PBS:磷酸缓冲液PPR:小反兽疫PPRV:小反台兽疫病毒SPG:链球菌 G蛋白4主要设备4.1恒温箱。4.2电子天平：精确值0.0001g。4.3台式冷冻离心机：最大离心力15000g。4.4 pH计。4.5试纸喷膜仪。4.6试纸条切割机：可连续切割出2mm～5 mm宽试纸5主要试剂和材料除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合GB/T6682规定的三级水。5.11%氯金酸溶液（AuCl3·HCl·3H2O)。5.2PBS:配方见附录A。5.33PPRV N蛋白:为基因工程表达蛋白抗原。5.4链球菌G蛋白（SPG）。1 SN/T 3971--20145.51%柠檬酸钠溶液。5.61%碳酸钾溶液(K²CO:）:配方见附录 A。5.7抗SPG多克隆抗体。5.8牛血清白蛋白。5.9硝酸纤维素膜。5.10玻璃纤维棉纸。5.11干燥剂。5.12PPRV阳性血清，由指定单位提供。5.13PPRV阴性血清，由指定单位提供。6检测原理将胶体金标记的SPG固定于金标垫，检测线为纯化的PPRVN蛋白，对照线为免抗SPG。检测时，阳性样品中的抗PPRV抗体与胶体金标记SPG特异性地结合，在NC膜上移动时，被检测线上的PPRVN蛋白捕获，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。相反，阴性样品中不含抗PPRV抗体，在检测线处不形成红色条带。对照线试剂免抗SPG与胶体金标记SPG结合，捕获金标复合物，形成对照线。7免疫胶体金试纸卡的组装7.1金标SPG及金标垫的制备首先用1%碳酸钠溶液调胶体金溶液的pH值为6.5，向50mL胶体金溶液中缓慢地加人适量SPG溶液，室温搅拌30min，缓慢加人10%BSA至其终浓度为1%（质量浓度），继续搅拌30min。4℃4000 g 离心10min,将上清转移至另一离心管中,4℃ 12 000 g 离心30 min，小心弃去上清。用5mL（即1/10原体积）PBS（pH7.0）重悬沉淀。加人1%（质量浓度）的叠氮钠（NaN3）溶液至终浓度为0.02%，用试纸喷膜仪将胶体金溶液喷于300×5mm玻璃纤维棉上，速度为50μL/cm，并于4℃真空抽于,于 4 ℃干燥保存备用。7.2检测线和对照线的制备用纯化的浓度为2mg/mL的PPRVN蛋白和兔抗SPGIgG分别作为检测线和对照线试剂。用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点样速度为0.75μL/cm。37℃干燥2 h，4℃密封保存备用。7.3试纸卡的组装按图B.1所示，将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起，并用试纸条切割机将其切成3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中，将试纸卡放人含有干燥剂的密封袋内，密封后于2℃～8℃保存备用。8样品采集、处理和保存采集动物血样，室温静置约30 min,使血液自然凝固。5000g离心10 min，收集上清液转移至另一离心管中,于56℃水浴中作用30 min后，待血清样品恢复室温后用于检测。血清样品也可放 4℃暂时保存（不超过7d)或一70℃长期保存。样品的运输按 SN/T2123执行。2 SN/T 3971—20149样品检测9.1从2℃～8℃冰箱中取出带包装的试纸卡,在室温放置约 30 min。9.2样品稀释，分别用样品稀释液（见附录 A)将 PPRV 阳性血清、PPRV阴性血清