SN_T 4732-2016香蕉细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4732-2016香蕉细菌性萎蕉病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas campestris pv. musacearum2016-12-12发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局专 SN/T言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：冯建军、汪莹、章桂明、龙海、吴绍精、王红英， SN/T 4732—2016香蕉细菌性萎蕉病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了香蕉细菌性萎蕉病菌（Xanthomonascampestrispv.musacearum）的检疫鉴定方法。本标准适用于香蕉茎、叶、果实等组织材料中香蕉细菌性萎病菌的检疫和鉴定。2香蕉细菌性萎蕉病菌基本信息学名:Xanthomonas cam pestris pv. musacearum （Yirgou Bradbury 1968) Dye 1978异名:Xanthomonas vasicola pv. musacearum Aritua et al 2008病害英文名：Bananaxanthomonaswilt分类地位：原核生物界（Procaryotae）、变形菌门（Proteobacteria）、-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、黄色单胞菌目（Xanthomonadales）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、黄单胞菌属（Xanthomonas）。远距离传播主要途径为带菌的果实、叶等植物材料以及昆虫的传播其他资料参见附录A。3方法原理本标准主要依据香蕉细菌性萎病菌为害症状、菌落形态特征、生理生化特征、致病性特性以及GspD基因特性和小分子多肽靶标分子标记特性等相关信息而制订。4仪器、用具及试剂4.1仪器PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS)。4.2用具可调移液器（最大量程为20μL、200μL、1000μL）及相关吸头、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。4.3试剂与培养基除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。培养基和试剂配方见附录B、附录C、附录D和附录E。5检疫鉴定5.1现场检疫5.1.1症状观察仔细检查，现场对香蕉叶、茎以及果实等组织材料进行症状观察，症状描述参见A.4。1 SN/T4732—20165.1.2样品抽取发现可疑样品，切除受害部位组织或整棵植株带回实验室检测。5.2实验室检测鉴定5.2.1病原菌分离选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用75%酒精表面消毒1min～2min，然后用无菌水清洗2次，再加适量无菌水浸泡15min～20min。用接种环蘸取浸泡液接种到CCA或YTSA-CC半选择性培养基，分别置25℃培养6d或28℃培养48h后观察菌落形态特征。挑取可疑菌落划线接种NA纯化培养做进一步鉴定。香蕉细菌性萎焉病菌菌体杆状，革兰氏染色阴性，单生极鞭；该病菌在CCA半选择性培养基上25℃黑暗培养6d后，呈现黄色、圆顶形菌落，其直径为3mm～4mm；在YTSA-CC半选择性培养基上28℃黑暗培养48h后，呈现黄色、有光泽、圆顶形的黏稠状菌落，其直径为2mm～3mm；在NA平板上菌落呈黄色、凸起、黏稠状。5.2.2生理生化指标测定将可疑分离物菌株进行生理生化指标测定，包括氧化酶、淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化等试验，见附录C。或采用BIOLOG微生物鉴定系统替代。香蕉细菌性菱焉病菌生理生化指标特征参见A.4。5.2.3PCR检测挑取经NA平板上28℃培养48h后的菌落或疑似病害组织提取DNA模板进行PCR扩增。用无菌水做空白对照，用香蕉细菌性萎病菌已知菌株DNA做阳性对照，扩增产物经电泳后照相观察结果，见附录D。5.2.4MADLI-TOFMS检测MADLI-TOFMS检测程序见附录E。5.2.5致病性测定如有需要，致病性试验采用注射方式接种。用一次性注射器吸人培养过夜的浓度为10°CFU/mL的细菌悬浮液后，注射到3株～5株健康香蕉幼苗（组培幼苗最佳）植株上部幼叶或（假）茎基部。阴性对照用无菌水代替接种液。接种后的植株放置在28℃～35℃温度下，先在100%相对湿度保湿24h～48h，然后转移到80%左右的相对湿度下，每天70001x～100001x光照培养16h，黑暗培养8h。接种后5d开始观察症状，7d～10d后植株表现出萎黄化、在（假)茎基部