SN_T 3398-2012大豆检疫性病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3398—2012大豆检疫性病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法Detection for quarantine viruses on soybean by multiple-real time RT-PCR2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3398—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：郑耘、章桂明、冯建军、卢小雨、汪莹、李一农。I SN/T 3398--2012大豆检疫性病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法范围本标准规定了烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法本标准适用于大豆及其加工产品中上述五种病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1rse transcription polymerase chain reaction ; RT-PGR逆转录-聚合酶链式反应逆转录-聚合酶链式反应，简称 RT-PCR,在适宜的反应条件下，以样品中抽提出的RNA为模板，逆转录酶在适宜的反应条件下,RNA被逆转录成cDNA，再以cDiNA为模板进行PCR扩增。3. 2多重实时荧光 RT-PCR maltiple-real time RT-PCR依据荧光信号随着RT-PCRF产物数量增加而同步放大的原理，在RT-PCR扩增的过程中，同时连续监测反应体系中不同标记的多种病毒扩增片段荧光信号的变化，根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，得出大于平均值的荧光值即阈值，收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数，即Ct值。根据多种病毒荧光信号的Ct 值判断样品是否带有该多种检疫性病毒。4原理采用多重实时荧光RT-PCR方法检测烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒（参见附录 A）。5仪器设备和用具烘箱、高压灭菌锅、水浴锅、低温冰箱、纯水仪、高速冷冻离心机、实时荧光PCR仪、微量移液器(0.1 μL～2.5 μL,2 μL～20 μL,20 μL～200 μL,100 μL～1 000 μL）、旋涡振荡器、超净工作台、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、各种吸头（1000 uL、200 μL、10 μL）、离心管（1.5 mL、0.6 mL、0.2 mL）。 SN/T 3398—20126 主要试剂主要试剂和缓冲液参见附录B。７取样方法样品取样方法按照SN/T2122执行。8样品的制备8.1种子类随机抽取100粒种子，将其分为五组，在适宜的发芽温度（20℃～28℃）条件下催芽，直至长出第一对真叶。随机抽取20株苗叶片，每株取1g叶片，制备成一个样品。8.2苗木类将繁殖材料种植在隔离温室中，于 25℃生长并观察症状。取1 g表现症状和无症状植株的叶片(或花芽），制备成一个样品。8.3鳞球茎类将至少20个（头）鳞球茎或块茎芽眼（处于休眠状态的还要打破休眠）在生物培养箱（20℃～28℃）中催芽，直至长出叶片。随机抽取1g叶片，制备成一个样品。9五重实时荧光RT-PCR检测反应中空白对照为双蒸水，阴性对照为不含有五种病毒的RNA，阳性对照为含有五种病的RNA，待测样品的RNA为模板，每个样品重复三次。具体操作过程参见附录 B。10结果判断及表述10.1实时荧光 RT-PCR在阳性对照Ct值小于30.0，水空白对照Ct值等于40.0的条件下（若不满足该两项条件，此次检测无效，应重做荧光PCR扩增）：a）待测样品中标记为烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的荧光信号的Ct值为40时，则判定未检测到病毒；b）待测样品中标记为烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的荧光信号的Ct值小于或等于35时，则判定检测到该病毒或该几种病毒；c）待测样品中标记为烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的荧光信号的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值为40时，则判定未检测到病毒；如果重新测试的Ct值小于40而大于35时，则判定检测到该病毒或该几种病毒。2 SN/T 3398--201210.2结果表述检出结果表述如下：a)检出