SN 1139-2002蚕豆染色病毒血清学检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1139—2002蚕豆染色病毒血清学检测方法Serological detection method of broad bean stain comovirus2002-08-02 发布2003-01-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN /T 1139-2002前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：陶庭典、许志刚、易建平、印丽萍、杨翠云。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1139--2002蚕豆染色病毒血清学检测方法1 范围本标准规定了蚕豆染色病毒的DAS-ELISA检测方法。本标准适用于蚕豆种子、种苗及其他相关作物中蚕豆染色病毒的检测。检测蚕豆及其他作物种子内的病毒时，其种子须经发芽或种植并形成小苗后再进行检测。2缩略语以下缩略语适用于本标准。DAS-ELISA双抗体夹心酶联免疫吸附分析法PBS磷酸缓冲液10XPBS10倍浓度的PBS母液，用来快速配制PBS缓冲液PBST含吐温-20 的 PBSSEB样品抽提液IgG指纯化的蚕豆染色病毒抗体IgGCoating-IgG指用于包被酶联板的蚕豆染色病毒的抗体 IgGIgG-conjugate指用碱性磷酸酶标记过的蚕豆染色病毒的抗体 IgGCB包被缓冲液3方法提要及其依据蚕豆染色病是Iloyd等于1965年在英国的蚕豆上发现的。它是一种直径约28nm的球状病毒。主要分布在非洲和欧亚地区。蚕豆染色病毒属于豆花叶病毒科(Comoviridae）、豇豆花叶病毒属（co-movirus）。蚕豆染色病毒具有中等强度的免疫源性，产生的抗体可以用作各种血清学反应。感病叶片汁液中含有较多的病毒粒体，可以通过血清学反应进行检测。血清学方法中的DAS-ELISA是一种稳定性好、特异性强的方法，本标准采用被国内外广泛使用的DAS-EILISA方法检测蚕豆染色病毒。4仪器设备4.1 酶联板。4.2可调式移液器(2.5 μL、10 μl、100 μL、200μL、1000 μL各一支)及相应吸头。4.312孔道200μL可调式移液器及吸头。4.4酸度计。4.5调温水浴锅或调温培养箱。4.6ELISA洗板机（不是本标准所要求的）。4.7 酶标仪。4.8微量样品榨汁机（无微量样品榨汁机时，用研钵进行手工研磨制样）。4.9 量筒(10 mL、20 mL,50 mL、100 mL、500 ml,l 000 ml,各-个)。4.10分析天平：精度1/10000g。4.11 试剂瓶(10 mL、50 mL、100 ml、500 mL、1 000 mL 各两个)。1 SN/T 1139--20024.12封口膜。4.13吸水纸。5 试剂、溶液及生物制剂本标推中所有化学试剂的纯度除特别说明外均为分析纯。5.1 10×PBS 的配制a）81.8g氧化钠；b）1.49g氯化钾，c）2.72g 磷酸二氢钾d）14.2g 磷酸氢二钠(NazHPO,·2H,O);加水定容至 1 L。e）5.2 PBS的配制100 mL10XPBS;a）b）850 mL水;调节 pH 至 7. 4后再用水定容至 1 L。c)5. 3 PBST 的配制在 PBS 中加人 Tween-20,使 Tween-20 的浓度为 0.1%。5.4 SEB 的配制在PBS 中加人以下试剂配制 SEBa）聚乙烯毗咯烷(使其终浓度为2%);b）卵白蛋白(使其终浓度为0.2%);Tween-20(使其终浓度为0.05%);c）NaN:（使其终浓度为0.05%）。d）5.5 CB 的配制1.59g 碳酸钠;a）b）2.94 g碳酸氢钠;0.50g 叠氮化钠c)d)900 mL 水，e）调节 pH至 9.6后再用水定容至 1 L。5.6ELISA 底物的配制用 10%二乙醇胺溶液将对硝基苯磷酸配制成 1mg/ml 的浓度(现配现用)。5.7 包被用 IgG纯化的蚕豆染色病抗体IgG，使用国内外正式注册的商品，根据供应商的要求用SEB稀释为工作浓度。5.8 IgG-conjugate碱性磷酸酶标记的蚕豆染色病毒抗体,使用国内外正式注册的商品，用SEB稀释为工作浓度。6样品6.1阳性对照样品：蚕豆染色病毒的纯病毒或者病组织，由抗血清供应商提供，用 SEB制备。6.2阴性对照样品：由抗血清供应商提供，用SEB制备。6.3 空白对照:SEB 作空白对照。6.4待测样品的制备6.4.1待检测的样品为种苗时，将叶片用SEB作为抽提液（样品与SEB的比率为1：10左右)进行榨2 SN/T 1139—2002汁，榨汁工具为微量样品榨汁机，没有微量样品榨汁机的则手工研磨，所得汁液直接用于检测。6.4.2待检测的