SN_T 5131-2019人参鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01B 38SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5131—2019人参鉴定方法Identification of Panax ginseng C.A.Meyer2019-09-03 发布2020-03-01实施河中国海南出版社有限公司HG944440016686中华人民共和国海关总署发布活典:www.customskb.conm刮开涂层激活密码 SN/T 5131--2019前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国大连海关、中国医学科学院药用植物研究所。本标准起草人：孙涛、孔德英、滕少娜、蒋丹、邓朝晖、姚辉。 SN/T 5131--2019人参鉴定方法1范围本标准规定了人参的 DNA条形码检测鉴定方法本标准适用于中药材人参、饮片及其基原植物的检验鉴定，不适用于提取不到核酸的深加工产品和粉末混合物。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA条形码DNA barcode生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2 internal transcribed spacer; ITS内转录间隔区真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA 4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元。三者高度保守，适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析，其间的间隔区为内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS)，由 ITS1-5.8S-ITS2 组成，由于进化相对迅速而具多态性，ITS2序列被推荐为药用植物 DNA条形码序列,用于系统学研究。4 基本信息中文名：人参。学名: Panax ginseng C.A.Meyer.分类地位：五加科（Araliaceae)，人参属（Panar L.）。《中国药典》(2010 版)描述人参本品为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎。多于秋季采挖,洗净经晒干或烘干。栽培的俗称“园参”;播种在山林野生状态下自然生长的称“林下山参”，习称“籽海”。人参的其他资料参见附录 A。1 SN/T 5131---20195　方法原理采用 DNA 条形码标准方法流程，以ITS2 序列为条码基因,将样品进行 DNA 提取→PCR 扩增-→测序→BLAST 比对分析,根据人参的 ITS2序列特征,对样品进行鉴定。6仪器和试剂6.1仪器PCR扩增仪、紫外分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、烘箱、高压灭菌锅、电子天平（感量1/1000）、球磨仪或研钵、水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、冰箱、微量移液器（2μL，10μuL,20 μL，100 μL,200 μL,1 000 μL)、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 反应管。6.2 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682的要求。CTAB提取液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、RNase A、液氮、10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs）、ExTaq聚合酶、引物(见表 1)、DNA Marker、琼脂糖、溴化乙锭(EB)。７检测方法7.1样品的处理除特殊标明外，样品使用75%酒精擦洗表面后晾干。7.2 DNA 提取见附录 B。7.3DNA 纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DNA 的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA 纯度=OD260/OD280DNA 浓度= 50XOD260 μg/mLPCR级 DNA溶液的 OD260/OD28o比值应为 1.7～1.9。7.4 PCR 检测7.4.1 引物人参DNA条形码方法鉴定PCR扩增引物序列见表1。表 1 引物序列目标基因引物名称序列条带大小ITS2FATGCGATACTTGGTGTGAATITS2500 bpITS3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT2 SN/T 5131—20197.4.2反应体系反应体系见表2。表 2 反应体系PCR反应体系终浓度试剂名称1XPCR缓冲液10×PCR 缓冲液(不含 Mg²+）2 mmoL/LMgCl2 溶液0.2 mmoL/L