SN_T 2948-2011国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2948—2011国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法Rapid detection of tick-borne Xinjiang hemorrhagic fever virus at frontier port2011-12-01 实施2011-05-31 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局D数码防 SN/T 2948—2011前言本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：师永霞、李小波、相大鹏、孙肖红、洪烨、郑夔、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、钟玉清。 SN/T 2948-—2011国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法1范围本标准规定了国境口岸蜱传新疆出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，蜱传新疆出血热的免疫胶体金检测,RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出镜人员或媒介蜱携带新疆出血热病毒的快速检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR:反转录-聚合酶链反应实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数1RNA:核糖核酸FAM:FAM荧光染料，一·种荧光报告基团4术语和定义下列术语和定义适用于本文件4.1新疆出血热（克罗米亚-刚果出血热）Xinjiang hemorrhagic fever(Crimean Congo hemorrhagicfever)是由新疆出血热病毒(克罗米亚-刚果出血热病毒)引起的、硬蜱传播的自然疫源性传染病。临床上以发热、头痛、出血、低血压休克为特征。亚洲璃眼蜱(Hyatomma asiaticum)是本病的主要传播媒介。5生物安全要求新疆出血热病毒相关材料的生物安全要求如下：新疆出血热病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级(BSL-3 或 ABSL-3)实验室内进行;新疆出血热病毒相关的灭活材料在生物安全ⅡI级(BSL-2)实验室内进行；新疆出血热病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。 SN/T 2948-20116标本的采集、运输和保存6.1 人血清无菌采集疑似患者发病5d内静脉血3mL～5mL，室温静置30min使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测或一70℃以下保存待检。6.2硬蜱根据实际工作需要采集蜱标本。将采集的蜱直接放人一20℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按30只～50只一份，装入2mL螺口塑料血清管内，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或一70℃以下保存待检。7标本的处理7.1 血清标本血清标本直接进行胶体金检测和分子生物学核酸的提取，如不能及时检测应存放在一70℃冰箱。7.2　蜱标本7.2.1 在冰上操作。从一70℃容器中取出蜱标本,倒人研磨器中。7.2.2加人 1mL PBS或生理盐水吹洗,弃去液体后加人 1mL PBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失。7.2.3将研磨液吸人1.5mL离心管，配平后置预冷4℃的离心机上，20000g离心10min。7.2.4取上清液进行胶体金检测和分子生物学核酸的提取。8蜱传新疆出血热的免疫胶体金检测8.1仪器本方法使用的主要仪器如下；一生物安全柜；—移液器:100μL、200 μL。8.2 试剂新疆出血热免疫胶体金检测试剂盒：由广州万孚生物技术有限公司提供1。8.3检测步骤8.3.1将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。8.3.2取适量体积的血清样本或蜱样本的处理液，与等体积的样本处理液混匀。8.3.3吸取80μL的混合液于检测卡的样品孔中。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 2948—20118.3.410 min后观察结果，最长不超过 15 min。8.4结果判断根据以下条件进行结果判定：-阳性结果:在检测区(T)及对照区(C)各出现一条色带;阴性结果，仅在对照区出现一条色带；检测无效；在对照区无红色条带出现，应重新进行检测。9RT-PCR 检测9.1主要仪器9.1.1 PCR扩增仪。9.1.2 天平。9.1.33超净工作台。9.1.4生物安全柜。9.1.5高压灭菌