SN_T 3993-2014箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3993--2014箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范Quarantine protocol for infection with batrachochytrium dendrobatidis2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3993—2014前言本标准按照GB/T1.12009 给出的规则起草本标准非等效部分采用世界动物卫生组织（0IE)《水生动物疾病诊断手册》（2012版）第2.1.1章等有关章节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。本标准主要起草人：谢明星、彭小莉、石建平、刘棠、王群力、陈双雅、陈伟玲、许秋贝、孙福泉、王景明。I SN/T 3993—2014箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范1范围本标准规定了箭毒蛙壶菌感染的临床诊断、实时荧光聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于箭毒蛙壶菌感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(base pair)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)FAM:荧光报告基团（Carboxyfluorescein)MGB:荧光淬灭基团(Minor groove binder)Real-time PCR:实时荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction)Tag:水生热栖菌(Thermus aquaticu)4仪器和试剂4.1仪器4.1.1冷冻离心机。4.1.2-20℃低温冰箱。4.1.3组织匀浆器。4.1.4实时荧光 PCR反应管。4.1.5实时荧光PCR仪。4.1.6高压灭菌器。4.1.7紫外分光光度计。4.2试剂4.2.1水应符合GB/T 6682中一级水规定。含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。4.2.2TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(含 dNTP、Taq 聚合酶和 PCR 反应缓冲液等）。4.2.31 SN/T 3993—20144.2.4蛋白酶K、酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1）、三氯甲烷/异戊醇混合液（24：1）、75%乙醇和TE缓冲液（见A.1）5临床诊断一般认为所有的两栖类均可感染，包括无尾目（青蛙和蟾蜍）、有尾自（蝶螈、水螈、鳗螈)和蚓螈目（真蚓)所有成员。目前发现有14科250种以上两栖动物感染箭毒蛙壶菌感染。箭毒蛙壶菌感染在大多数情况下没有明显的临床症状，只有那些快要死亡的动物表现明显。患病的成体蛙类腹部、髋部、腿部皮肤出现弥散性红肿、局部轻度增厚和变色症状，后肢抽搐、身上积聚脱下的皮、脚部及其他部分的浅表皮脱落、皮肤出现轻微粗化及细小的溃疡或出血。愚者行为上表现无力、厌食、精神沉郁、不能找到遮蔽处、不能逃跑、失去正常的反射作用及出现不正常姿势等神经症状。蝌蚪的口器变形和角质化可作为箭毒蛙壶菌感染的检测依据。63实时荧光 PCR 反应6.1　采样根据GB/T18088的要求采集成年蛙的脚趾和腹部的皮肤、蝌蚪的口器、成年蛙腹部的皮肤和蝌蚪口器的棉拭子或蛙和蝌蚪浸泡液（见A.2）等。将感染的蛙放人含有浸泡液的容器中浸泡15min用于检测。在进行大规模的流行病学调查时可将不超过5条蛙病料混合在一起作为一个检样进行检测。最佳的器官和组织是成年蛙的腹部皮肤和脚趾，蝌蚪的口器6.2核酸抽提用经典的酚三氯甲烷萃取法（见附录B)或商业化DNA提取试剂盒。6.3引物和探针引物序列：ITS1-3: 5-CCT-TGA-TAT-AAT-ACA-GTG-TGC-CAT-ATG-TC-35.8S:5-AGC-CAA-GAG-ATC-CGT-TGT-CAA-A-3探针序列：5-FAM-CGA-GTC-GAA-CAA-AAT-MGB-36.4　PCR 扩增体系PCR扩增在标准的 25μL的反应体系中进行，每个反应体系应设置三个平行反应。包括：Taq Man Fast Universal PCR Master Mix(2 X )12.5 μLITS1-3 引物(10 μmol/L)0.5 μ5.8S引物(10 μmol/L)0.5 μL探针(10 μmol/L)0.5 μl.DNA 模板(