SN_T 2766-2011国境口岸螨类携带汉坦病毒的RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2766—-2011国境口岸螨类携带汉坦病毒的RT-PCR检测方法RT-PCR detecting method for hantavirus in mite at frontier port2011-02-25发布2011-07-01实施中华人民共和国发布量国家质量监督检验检疫总局文訪 SN/T 2766—2011前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郭天宇、刘佳、任彤、刘艳华、郭敏卓、刘韦华、左曙青、宋锋林 SN/T 2766—2011国境口岸螨类携带汉坦病毒的RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了采用RT-PCR方法检测螨类携带汉坦病毒汉滩型（HTN）、汉城型（SEO)的检测对象、检测方法、结果报告和实验室生物安全要求本标准适用于出人境检验检疫机构对螨携带汉坦病毒 HTN型、SEO 型的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求SN/T1552国境口岸生物因子恐怖事件监测规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文和3. 1螨类 mites节肢动物门蛛形纲（Arachnida)蜱螨亚纲（Acarina)中除蜱以外的所有种类的统称。本标准涉及的螨类是指在医学上有重要意叉的吸血兼掠食型和吸血型螨类，3. 2汉坦病毒hantavirus布尼亚病毒科汉坦病毒属,单股负链RNA病毒，在我国主要流行为汉滩型和汉城型，是肾综合征出血热(HFRS)的病原体。4生物安全措施4.1个人防护采集螨类标本时注意做好个人防护，避免螨虫叮咬。个人防护办法可参照SN/T1552。4.2实验室生物安全要求样品前处理和病原体检测应在生物安全2级及以上实验室进行。实验室应遵循GB19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。4.3消毒措施实验前后使用有效的紫外灯照射消毒15 min，紫外灯需要定期检测、更换。实验完毕后所有可用 SN/T 2766-2011高压消毒的器材均应在实验室内进行高压消毒；不能用高压消毒的器材及实验台面和污染的设备表面用75%酒精消毒。实验废弃物应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。5器材与试剂5.1器材PCR扩增仪、电泳仪及电泳槽、高速台式冷冻离心机、玻璃研磨器或匀浆器、液氮罐、冰箱（温度范围包括2℃～8℃和一20℃～一80℃）、生物安全柜、凝胶成像系统、水浴锅、微量移液器及配套带滤芯吸头(10μL、100 μL、1000 μL)、离心管(1.5 mL、0.5mL和0.2 mL)、微波炉。所有耗材（离心管、吸头、玻璃研磨器或匀浆器等)都应不含有RNA酶，如不能保证则可用焦碳酸二乙酯(DEPC)水或其他清除 RNA 酶的试剂处理。玻璃器血需在 300℃干烤 4 h。整个RNA制备的操作过程中应戴无粉乳胶手套。5.2 常用试剂5.2.1实验用溶液用于RNA制备和反转录过程所用的溶液都应保证不含有 RNA 酶，如不能保证需用 DEPC 处理，以使RNA 酶失活（但用 DEPC处理含有 Tris的溶液效果不好）。DEPC处理溶液：100mL溶液中加入0.2mL DEPC，剧烈振荡使DEPC溶于溶液中,37℃（温箱）处理24 h,高压以灭活残留的DEPC,分装备用。使用DEPC时应戴手套并在通风橱中操作。5.2.2Taq 酶及缓冲液-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。5.2.3磷酸盐缓冲液(PBS)NaCI8gKC10.2g1.44 gNa2 HPO40.24 gKH, PO4加水溶解至1L,用盐酸调节至pH7.4。5.2.4 RNase 抑制剂(RNasin)20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5. 2. 5dNTP(10 mmol/L)含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。5.2.6Trizol5.2.7TBE缓冲液(5×浓缩液)或 TAE缓冲液(50×浓缩液)5×TBE缓冲液配方Tris54.0 g2 SN/T 2766-2011硼酸27.59 g Na2 EDTA3.72 g加水溶解至 1L,调节至 pH8.0。50×TAE缓冲液配方Tris 碱242 g冰乙酸57.1 mLNa2 EDTA · 2H,O37.2 g加水至 1L,调节至 pH8.0。5.2.8逆转录酶(AMV 或 M-MLV)一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。5.2.9其他试剂三氯甲