SN_T 2342.2-2010苹果皱果类病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2342.2—2010苹果皱果类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of apple fruit crinkle viroid2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2342.2-2010前言SN/T2342标准分为两个部分：苹果茎沟病毒检疫鉴定方法；苹果皱果类病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T2342的第2部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：李桂芬、魏梅生、张永江、马洁、相宁、李明福。 SN/T 2342.2-2010苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 范围1SN/T 2342的本部分规定了苹果皱果类病毒检疫鉴定方法。本部分适用于带有苹果皱果类病毒的进境种苗或其他繁殖材料的检疫和鉴定。2原理苹果皱果类病毒学名：Apple_fruit.crinkle viroid,缩写：AFCVd，苹果皱果类病毒的特性是本标准制定的主要依据;该类病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、地理分布、传播途径、基因组特征等参见附录 A。3仪器、用具和试剂仪器PCR 扩增仪。3.1.2电泳仪、电泳槽。3. 1. 3水浴锅。3.1.4高速冷冻离心机。3.1.5凝胶成像系统。3.1.6振荡器。3..1.7冰箱。3.1.8电子分析天平(0.001g)。3. 2用具3. 2. 1~2 μL,1 μL～10/μL,10lμL～100/μL,100 μL～1 000 μL)。可调移液器（0.1 μL3.2.2可调移液器吸头。3.2.3离心管。3.2.4研钵。3.3试剂3.3.1RNA 抽提缓冲液20 mmol/LTris-HC1,pH8. 010 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(CioH14 N2O:Na²·2H²O)0.8 mol/L氯化钠(NaCI)1%十二烷基磺酸钠(SDS)0.5%二乙基二硫代氨基甲酸钠(DIECA)2 %聚乙烯吡咯烷酮(PVP,MV24000-40000)0.5%巯基乙醇 SN/T 2342.2--20103.3.2 10 × TBETris890 mmol/L硼酸890 mol/L乙二胺四乙酸二钠(CioHi4N2O:Na²·2H,O)20 mmol/L调 pH至8.3,加双蒸水定容至1 L。3.3.3加样缓冲液2X TBE60%甘油0.06%溴酚蓝0.06%二甲苯蓝3.3.4固定液89%水9.5%乙醇1%冰乙酸3.3.5染色液1 g 硝酸银加双蒸水定容至500 mL。3.3.6显色液0. 4 mol/L氢氧化钠甲醛4 mL用双蒸水定容至 1 L。3.3.7 50 ×TAE242.0 gTris乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2²·2H²O）37.2 g57.1 mL冰乙酸用双蒸水定容至 1 L。4检疫鉴定方法往返聚丙烯酰胺凝胶电泳(return) RNA的提取取样：苹果苗木取枝皮部分，啤酒花取花或叶片。称取苹果枝皮、啤酒花的花或叶片样品（被检测样品、阳性样品一带有苹果皱果类病毒的植-不带有苹果皱果类病毒的材料)2g，液氮充分研磨成细粉末。加人2倍体积的物材料、阴性样品一RNA抽提缓冲液，再加人2倍体积的水饱和苯酚，室温振荡混合30min，10000r/min离心，10min。取上清液，加等体积的苯酚-三氯甲烷(1：1)抽提一次，10 000r/min离心10 min。取上清液,加人1/10体积的3 mol/L的乙酸钠，2.5倍体积乙醇。一80 ℃,30 min以上（或2 SN/T 2342.2-2010一20 ℃过夜）。13 000 r/min离心 15 min。沉淀经75%冷乙醇洗涤,真空干燥后溶于双蒸水中。4.1.2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%。在小烧杯中按顺序加人双蒸水 20.77 mL，30%凝胶储备液 6 mL，10×TBE缓冲液3mL，TEMED30αL，10%过硫酸铵（现配现用)200.μL。充分混匀后灌胶。然后插入样品梳。待胶完全凝聚后在电泳槽内加入1XTBE电级缓冲液，然后轻轻拔掉梳子。预电泳加样前进行预电泳，电压150 V,10 min。加样取10uL提取的 RNA样品（被检测样品、阳性样品、阴性样品），按1：1的比例加人加样缓冲液。第向电泳电极缓冲液为TBE，电压150V。当溴酚蓝移出凝胶板，二甲苯蓝接近胶底部时，停止电泳。第二向电泳弃去第一向电泳的电极缓冲液,先将 1XTBE缓冲液加热到80℃，倒在电泳槽内，保持温度 70℃～75℃，15min，使核酸完全变性，调转电极方向，电压为200V，至二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶项部，停止电泳