SN_T 3314-2012出口海产品中大田软海绵酸化学发光免疫分析检测方法.pdf

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3314—2012出口海产品中大田软海绵酸化学发光免疫分析检测方法Quarantine protocal for okadaic acid in export marine products byenzyme enhancement chemiluminescence immunoassay2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3314—2012前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所。本标准主要起草人：李健、李小林、张子群、王权、蒋蔚、刘迎春、陈永军、熊炜、胡永强。I SN/T 3314-2012出口海产品中大田软海绵酸化学发光免疫分析检测方法1范围本标准规定了海产品(牡蛎、贻贝、扇贝、蛤)中大田软海绵酸化学发光免疫分析操作方法。本标准适用于海产品（牡蛎、贻贝→扇贝一蛤蝌)中大田软海绵酸快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。OA:大田软海绵酸(okadaic acid)CLIA：化学发光免疫分析（chemilumintescent immuno assay)CPS：发光光子计数(count per Kecond)DSP:腹泻性贝类毒素(diarrhgtic shellfish pgisoning)HRP：辣根过氧化物酶（horseradish_peroxidise)4 试验原理一种有毒的C38多环脂肪酸，能够引起大田软海绵酸(OA)是腹泻性贝类森素的主要成分之一包括腹泻、恶心、呕吐、下腹疼痛等中症状，同时对人类也是强烈的致癌因子。本方法基于免疫学抗原抗体特异性反应原理。标准品或样品中的大田软海绵酸能与酶标板上的大田软海绵酸包被抗原竞争性地结合定量的抗体，加入酶标羊抗鼠二抗和发光底物液后，通过多功能酶标仪或发光计数器检测样品的发光值，发光值与样品中的大田软海绵酸浓度成反比，从而达到定量测定样品中OA的目的。5试剂和材料本标准所用水应符合 GB/T 6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外,均指分析纯试剂。5.1甲醇：液相色谱纯。5.2 OA标准液。5.30A单克隆抗体。5.4　HRP偶联酶标二抗。5.5 0A抗原。5.6洗涤液，底物液（A、B)，一抗稀释液，二抗稀释液等见附录 A。 SN/T 3314—20126仪器设备6.1走超声波仪。6.2大容量多管离心机。6.3旋涡混匀器。6.4　多功能酶标仪或发光计数器。6.5组织捣碎机。6.6　10号筛网。7样品前处理7.1试样制备7.1. 1牡蛎、蛤及贻贝用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳。开壳前不应加热或用麻醉剂。用清水淋洗内部以去除泥沙及其他物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。收集约50g贝肉置于10号筛网中沥水5min（不要使贝肉堆积），捡出碎壳等杂物，将贝肉均质。7.1.2扇贝取可食用部分用于检测。沥干及均质过程同7.1.1。7.1.3贝类罐头将罐内所有内容物（肉及液体)倒人均质器充分均质。如果是大罐，将贝肉沥水并收集沥下的液体，分别称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质。7.1.4　冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的)呈半冷冻状态，按7.1.1方法开壳、淋洗、取肉、均质。7.1.5贝肉干制品干制品可于蒸馏水中浸泡（冷藏），沥干及均质过程同7.1.1。7.2提取称取已组织匀浆贝类样品2.0g士0.01g，置于洁净的15mI.离心管中,加人2ml甲醇/水（8：2)溶液,旋涡，超声 10 min,3500 r/min离心10 min。将上清液移至另一15 mL离心管中，再用2mlL甲醇/水溶液重提，合并提取液，取1.5ml12000r/min离心，取0.1ml上清液加人等量20%甲醇水混匀后，加50%甲醇稀释至5倍用于检测。8操作步骤8.1将包被 OA抗原的酶标板及其他试剂恢复至室温。8.2加OA标准品/样本：加人OA标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中，然后加人OA抗体试剂50 μL/孔，轻轻振荡混匀,加盖，在 37℃孵育 90 min。2 SN/T 3314—20128.3洗板：将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤 4～5次，每次间隔10 s，在吸水纸上拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破