SN_T 3069-2011苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3069—2011苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Sphaeropsispyriputrescens2011-09-09 发布2012-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3069—2011言前本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、青岛农业大学。本标准主要起草人：邓丛良、李宝华、吕玉峰、张凯、梁新苗、汪万春、高文娜。 SN/T 3069—2011苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于来自苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌发生国家或地区相关寄主新鲜果实中的苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2077进出境苹果检疫规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1子实体fruit body无论是无性繁殖或有性繁殖、结构简单的或复杂的真菌产孢机构，统称为子实体。3. 2分生孢子器 sporodochidium半知菌球壳孢目真菌形成的一种子实体,球形或瓶形,产生分生孢子。3.3分生孢子　condidium半知菌的分生孢子着生在散生、束生的分生孢子梗或分生孢子座上，或着生在分生孢子盘或分生孢子器内。分生孢子的形态变化很大，大致可分为7种类型。4　方法原理4.1分类地位英文名:Sphaeropsis Rot学名:Sphaeropsis pyriputrescens Xiao J. D. Rogers 2004苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌属真菌界（Fungi），半知菌亚门（Deuteromycotina），腔菌纲（Coelo-mycetes),球壳孢目(Sphaeriales)。4.2检疫鉴定依据以病菌在寄主上的症状特点、病菌形态学特征及其培养特性、病菌种的特征以及基因组序列作为苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定依据，必要时辅助进行致病性测定（见附录A、附录B、附录 C、 SN/T 3069-2011附录 D)。5设备及用具5.11仪器设备体视显微镜、生物显微镜、电子天平（感量0.01g）、高压灭菌器、超净工作台、生物培养箱（带荧光灯）、高速离心机、PCR仪、实时荧光PCR仪、凝胶电泳和成像系统。5.2实验用具标签、定性滤纸、样品袋、保鲜袋、手持放大镜、镊子、解剖刀、酒精灯、接种针、培养皿（直径9.0cm）、烧杯（500mL）、量筒（500mL）、三角瓶（250mL）载玻片盖玻片、微量移液器（可调式范围：2.5μL～1000 μL)、移液器枪头(10 μL、100 表L、1000 μl）。6 试剂和培养基6.1 试剂1%NaCIO溶液、无水乙醇、70%乙醇无菌双蒸水、2%CTABDNA提取缓冲液、10%SDS溶液、3mol/L醋酸钠溶液、PCR试剂（包活 Taq聚合酶、aNTP缓冲液）实时荧光 PCR混合液、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCI、EDTA、IT引物、实时荧光PCR引物和探针琼脂糖、DNA相对分子质量标准(DL 2000 Marker)、0.5× TBE电泳缓冲液。6.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(见附录 A)7 标准菌株Sphaeropsis pyriputrescensXiao (Rogers8抽样口岸查验进境水果时，按 SN/T 20%Z.对来自疫区的苹果和黎果实球壳孢腐烂病菌寄主的新鲜果实进行抽样与取样。9检验方法9.1现场检验将有明显病症病果置于体视显微镜下检查，或直接挑取病部病原体制成玻片，置于生物显微镜下检查，观察记录有无病菌的分生孢子座、分生孢子器以及分生孢子的形态特征和着生方式，并测量其大小。9.2 实验室检验9.2.1显微镜检将有明显病症病果置于体视显微镜下检查，或直接挑取病部病原体制成玻片，置于生物显微镜下检2 SN/T 3069—2011查，观察记录有无病菌的分生孢子座、分生孢子器以及分生孢子的形态特征和着生方式，并测量其大小。9.2.2保湿培养如病果上只有可疑病状而无明显病症,则将病果置于样品袋中,于 20℃～25℃下保湿培养,定期观察症状的变化，并进行显微镜检或分离培养。9.2.3分离培养性状和形态学观察取可疑病果用70%的乙醇表面消毒，超净工作台上自然干燥，取病健交界的组织数块（大小约5mm×5mm）,置于PDA平板上，于20℃～25℃黑暗下近紫外灯下培养，待菌落出