SN_T 4163-2015国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4163---2015国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法Real time PCR detection methods of Lassa fever virus at ports2015-09-01实施2015-02-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局徐层查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法SN/T 4163-2015￥中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张 0.5字数 9 千字2016年4月第一版2016年4月第一次印刷印数1—1100书号：155066·2-29548＇定价14.00元 SN/T 4163—2015前言本标准按照GB/T 1.1--2009 给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所。本标准主要起草人：师永霞、史蕾、卓锦雪、丁国允、郑夔、袁志明、黄吉城、李小波、幸芦琴、洪烨、孙薇、黄弋、钟玉清、相大鹏、郭波旋。1 SN/T 4163—2015引言由于目前可获得的拉沙热病毒毒株之间基因变异比较大，难以找到所有毒株均保守的基因片段，本标准选用的引物及探针只是针对近十多年来世界各地发现的毒株的序列信息所设计，并不能保证所有不同地理来源的拉沙热病毒均可检出，特此说明。Ⅱ SN/T 4163—2015国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸拉沙热病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，拉沙热病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境疑似拉沙热病毒感染对象的实时荧光RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部）3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1拉沙热病毒Lassa fever virus属于沙粒病毒科，病毒直径约 80 nm～150 nm（平均 100 nm）,有包膜。拉沙热病毒的基因组为2条单股负链RNA(S和L），S 片段全长 3.5 kb，编码病毒的核蛋白（NP）和包膜糖蛋白（GP1、GP2），L 片段全长 7.2 kb,编码病毒 RNA 多聚酶和 Z蛋白。3.2拉沙热‧Lassa fever是由拉沙热病毒(Lassa fever virus)引起、主要经啮齿类动物传播的一种急性传染病。临床表现主要为发热、寒战、咽炎、胸骨后疼痛和蛋白尿，可出现多系统病变。本病主要在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚等西非国家流行。4缩略语下列缩略语适用于本文件。实时荧光 RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应;每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；Ct值:RNA:核糖核酸;FAM荧光染料，一种荧光报告基团。FAM:3生物安全要求拉沙热病毒相关材料的实验活动按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要1 SN/T 4163—2015求进行。6标本的采集、运输和保存6.1人血清无菌采集疑似病例发病 14 d 内静脉血 3 mL～5 mL，室温静置 30 min 使其凝固,500×g 离心10 min，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24 h 内不能送到实验室,将血清置于一70 ℃保存。6.2鼠排泄物将鼠液体排泄物2mL或固体排泄物2g装至有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或70℃以下保存待检。6.3鼠体标本无菌解剖可疑染毒鼠后，收集鼠脏器于有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或一70℃以下保存待检。7拉沙热病毒的实时荧光 RT-PCR检测7.1主要仪器本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、ⅡI A级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高速离心机（最大离心力20000×g）、漩涡振荡器、冰箱（4℃、20℃和一70℃)和移液器等。7.2主要试剂本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂如Qiagen 公司的QIAampViral RNAKit 提取病毒核酸!）、实时荧光RT-PCR通用试剂如 Ambion 公司的 Ag-Path-IDTMOne step RT-PCR Kit）、PBS溶液（pH7.0）、无RNA