SN_T 2850-2011病毒性出血性败血症检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2850-2011病毒性出血性败血症检疫技术规范Quarantine protocol for viral haemorrhagic septicaemia (VHS)2011-02-25 发布2011-07-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2850—2011前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)《水生动物病诊断手册2009版》第2.3.9章中病毒性出血性败血症的方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高隆英、张利峰、段宏安、史秀杰、徐晔、江育林。 SN/T 2850—2011病毒性出血性败血症检疫技术规范范围1本标准规定了病毒性出血性败血症病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)的检测，经细胞分离到病毒后，用间接荧光抗体试验（IFAT)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及测序等鉴定的检疫规范。本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的检疫诊断和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。BF-2:蓝鳃太阳鱼细胞系CPE(cytopathic effect):细胞病变效应DEPC：焦碳酸二乙酯dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)：脱氧核糖核苷三磷酸EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid):乙二胺四乙酸EPC:鲤鱼上皮瘤细胞系FCS(fetal calf serum):胎牛血清HEPES:N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸RTG-2:虹鳟鱼性腺细胞系RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction):逆转录聚合酶链式反应Taq 酶(Taq DNA polymerase):Taq DNA 聚合酶Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethane]:三(羟甲基)氨基甲烷VHSV(Viral Haemorrhagic Septicaemia virus):病毒性出血性败血症病毒4仪器和设备4.1超净工作台。4.2生化培养箱。4.3荧光倒置显微镜。4.4冷冻离心机。4.580℃超低温冰箱。V SN/T 2850-20114.6－20℃普通冰箱。4.7磁力搅拌器。4.8真空高压过滤器。4.9 PCR 仪。4.10微量移液器及吸头。4.11电泳仪。4.12凝胶成像仪或紫外透射仪。4.13酶标仪。4.14剪刀、镊子、离心管、PCR管和细胞培养器皿等耗材。5试剂和材料5.1水：应符合 GB/T 6682中一级水的规格，用于.RT-PCR时要用DEPC处理，除去RNA酶。5.2VHSV参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定提供。5.3抗VHSV的Ig(包被用)：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。5.4抗VHSV的抗血清和包被用Ig不是乘源于同一种动物：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。5.5FITC(fluorescein isothiocyanate)：标记的抗抗体：是抗5.4中所指动物的抗体。5.6辣根过氧化物酶标记的抗抗体：是抗5.4中所指动物抗体。5.7细胞生长液：含10%胎牛血清的-199.细胞培养液（含Earle~s.平衡盐的199培养基配制）（配制见附录A)。5.8细胞维持液：含2%胎牛血清的199细胞培养液（含 Earles平衡盐的199 培养基配制）。5.9无水乙醇,分析纯,使用前预冷到一20℃。5.10反转录酶AMV：一20℃保存,避免温度剧烈变化。5.11RNA酶抑制剂：一20℃保存,避免温度剧烈变化。5.12Taq酶：—20℃保存,避免温度剧烈变化，5. 13 DNA Marker 2000。5.14 琼脂糖。5.15引物:正向引物 F:5-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3反向弓引物 R:5-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCCiC-3该引物可以扩增 VHS病毒目前已知的 4个基因型所有毒株的 N-基因的 505个碱基片段(序列参见附录 B)。5.16丙酮:分析纯。5.17 0.05%吐温-