SN_T 3436-2012黎草花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3436—2012藜草花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of sowbane mosaic virus2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查药伪 SN/T 3436—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈青、李桂芬、黄峰、陈红运、廖富荣、林石明。 SN/T 3436—2012藜草花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法本标准适用于可能带有藜草花叶病毒的植物的种子、苗木及植物产品的检疫鉴定。2原理学名:sowbane mosaic virus缩写:SoMV分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus)成员。抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。详细资料参见附录A。3仪器、设备与试剂3.1仪器设备和用具微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、可调移液器（1000 μI、200 uL、20uL、2 uL）、96孔酶标板、研钵等;防虫温室。3.2试剂主要试剂和缓冲液见附录 B和附录 C。4检测样品的制备4.1种子样品制备挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中,待长出 3～4 片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组)并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。4.2　苗木有症状(如叶片畸形、花叶、斑驳等)的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同4.1。4.3植物产品植物产品有症状的部分（如：叶片畸形、花叶、斑驳等)单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样，分组编号，分组方法和检测方法同4.1。1 SN/T 3436—20125 检测与鉴定5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被SoMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了SoMV的植物组织作阳性对照），样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片)应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。5. 2RT-PCR 检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染SoMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作自对照。具体探作见附录C。6 结果判定如果2种方法检测结果为阳性，即列判断该批样品携带藜草花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，RT-PCR检测为阳性即可判断为样品携带藜草花叶病存。如果是称子直接检测，出现阳性结果时，需进行生物接种试验。7结果记录与样品保存7.1结果记录完整的实验记录包括：样品的来源、种辫、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据;PCR检测需有电泳结果照片。7.2样品保存经检验确定携带SoMV的样磊应在含适条件下保存，种子保存在4℃，病叶冻干保存在一20℃或者一80℃冰箱中，做好标记和登记工作。Z SN/T 3436--2012附录A(资料性附录）藜草花叶病毒相关资料A.1藜草花叶病毒学名和分类地位学名:sowbane mosaic virus缩写:SoMV分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）成员A.2抗原特性SoMV抗原性强。A.3粒体形态藜草花叶病毒粒体为球形，直径约为30nmA.4 基因组该病毒粒体包含 20%核酸和 80%的蛋白,基因组为 ssRNA，长 4.2kb,含有26%的G,23.2%的A,27. 2%的 C,23. 2%的 U,Sobemcus病毒基因组为单分体基因组，病毒 RNA的3端既无poly-A结构，也无tRNA结构，其RNA的端有一个VPg，可能是侵染所必需的。A.5 寄主范围藜草花叶病毒寄主范围有限，自然寄主为藜科（Chenopodiceae)植物，但是欧洲也发现很多果树和葡萄也感染藜草花叶病毒。有实验证明葡萄的分离物可经实验方法侵染其他科植物。A.6 病害症状昆诺藜：系统侵染，叶片斑驳、褪绿斑点，畸形，植株矮化。苋色藜：系统侵染，叶片斑驳、褪绿斑点，畸形，植株矮化。菠菜：系统隐症侵染。墙生藜:斑驳。甜菜：局部隐症侵染。A.7