SN_T 3306.3-2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第3部分：志贺氏菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.3-—2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP）检测方法第3部分：志贺氏菌Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 3 : Shigella2013-07-01实施2012-12-12发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第3部分：志贺氏菌SN/T3306.3-2012*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷美开本880×12301/16印张0.5字数10千字2013年6月第一版2013年6月第一次印刷印数1-1600*书号：155066·2-25404定价14.00元 SN/T3306.3—2012前 言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩散（LAMP)检测方法》共分为4部分：第1部分：鼠疫杆菌；第2部分：产毒素霍乱弧菌；第3部分：志贺氏菌；第4部分：嗜肺军团菌。本部分为SN/T3306的第3部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、正元盛邦（天津）生物科技有限公司。本部分主要起草人：左锋、柴宏森、李国鹏、杨春江、刘涛、祁军、谭绪良。 SN/T3306.3—2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第3部分：志贺氏菌1范围SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似传染病的粪便样品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP)法。本部分适用于国境口岸志贺氏菌的筛选检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS287—2008细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准3缩略语下列缩略语适用于本文件,BstDA聚合酶（大片段）。Bst酶:BstDNApolymerase(gment)argef唐核酸。DNA:deoxyribonucleic acid,月兑氧核dNTP:deoxyribonucleoside tr氧核苷王三磷酸。ate,iphoation，环介导恒温扩增LAMP:loop-mediated isothermnalampl4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测志贺氏菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施防止污染措施应符合WS/T230的规定。6技术概要根据志贺氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸1 SN/T.3306.3-2012根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.17引物：根据志贺氏菌属特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1环状引物2。外物1(F3，5-3）:GTTCCTTGACCGCCTTTCC外物2（B3，5-3)：GAGGGTTTTCCGGAGATTGT内物I(FIP,5-3):TTTCCAGCCATGCAGCGACCGATACCGTCTCTGCACGC内物2(BIP5-3)：CTCTGCGGAGCTTCGACAGCTCCCACAGCTCTCAGTGG环状引物1(LF,5-3）：CACCTGACTGCTTTATTTCA环状引物2(LB,5-3):AACTCAGACGGGATTTGTTAGG7.2Bst酶8U/μL。7.3dNTP:10mmol/L。7.410×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8）、100mmol/L(NH),SO4、100mmol/LKCl、