NY_T 1946-2010饲料中牛羊源性成分检测 实时荧光聚合酶链反应法.pdf

ICS 65.120B 46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1946-2010饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法Determination of bovine and ovine material in feeds-Realtime PCR method2010-09-21 发布2010-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1946-2010言前本标准遵照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）归口。本标准起草单位：上海市兽药饲料检测所、农业部饲料质量监督检验测试中心（西安）、新疆兽药饲料监察所、农业部饲料质量监督检验测试中心（成都）、天根生化科技(北京)有限公司。本标准主要起草人：金凌艳、张文刚、顾欣、黄士新、王蓓、沈富林、陈莉、达列亚、程传民、蒋彦波。I NY/T 1946--2010饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法1 范围本标准规定了饲料中牛羊源性成分的实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法及结果判定。本标准适用于动物源性饲料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中牛羊源性成分的定性检测。本方法的最低检出限为0.1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1　饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3定义和缩略语下列定义和缩略语适用于本文件。3. 1实时荧光聚合酶链反应real-time PCR聚合酶链反应(PCR)是通过特异性引物和模板 DNA 之间的序列特异性互补结合，在 DNA 聚合酶的作用下进行的定向酶促 DNA 片段扩增反应。实时荧光 PCR技术是指在 PCR 反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3. 2循环阈值cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阐值时所经历的循环数。3.3通用探针 universal probe能够同时检测出牛源性成分和羊源性成分的探针。3. 4牛探针bovine probe只能够检测出牛源性成分的探针。3. 5羊探针ovine probe只能够检测出羊源性成分的探针。3.6阳性对照 positive control已添加0.1%牛、羊源性成分的样品。3.71 NY/T 1946—2010 negative control阴性对照已知不含牛、羊源性成分的样品。3.8空白对照blank control等体积的双蒸水代替模板 DNA。3.9缩略语Ct:Cycle threshold,循环阈值DNA:Deoxyribonucleic Acid,脱氧核糖核酸Tris:Tris-(hydroxymethyl)Aminomethane,三羟甲基氨基甲烷SDS:Sodium dodecyl sulfonate,十二烷基磺酸钠dNTP:Deoxyribonucleoside Triphosphate,脱氧核苷三磷酸UNG:Uracil DNA Glycosylase,尿嘧啶 DNA 糖基酶Taq:Thermus Aquaticus,栖热水生菌MGB:Minor Groove Binder，小沟结合物4　原理根据牛、羊的线粒体 DNA的 D-loop区特征序列(参见附录 A)设计一对引物，同时扩增牛源性、羊源性线粒体DNA，并与标记有荧光物质的牛、羊通用探针、牛探针、羊探针进行特异性结合，利用荧光信号积累实时观察PCR的扩增曲线，从而对饲料中的牛源性、羊源性成分进行定性检测5抽样和制样5.1抽样方法按GB/T14699.1规定的方法进行样品采集。5.2样品制备按GB/T20195的规定制备试样。选取有代表性饲料样品至少500g，经粉碎机粉碎后，过孔径为0.2 mm的标准筛。混匀后,装入清洁容器内保存,防止交叉污染。5.3样品保存样品于4℃避光保存。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水应符合GB/T 6682一级水的要求。6.1DNA 提取试剂盒试剂6. 1. 1 缓冲液 I :50 mmol/L Tris-HCl 和 5%SDS,pH=8.0。称取 Tris 碱 6.057 g、SDS 50 g,加水900 mL使溶解,用浓盐酸(HCl)调 pH至 8.0,加水稀释至1000mL。6.1.2缓冲液Il:5mmol/L盐酸胍。称取盐酸胍0.478g,加水使溶解,并稀释至 1000 mL。6.1.3缓冲液Ⅲ:3mmol/L盐酸胍。称取盐酸胍0.287g,加水使溶解,并稀