SN_T 2772-2011国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2772--2011国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法Rapid detection of Japanese encephalitis virus frommosquitoes at frontier port2011-07-01 实施2011-02-25 发布中华·人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2772—2011前言本标准按照GB/T1:1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡孔新、王汉华、杨鹏飞、平芮巾、孙肖红、杨宇、王静、张乐。1 SN/T 2772--2011国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法范围本标准规定了国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法，包括样本抗原和核酸快速检验鉴定方法及检测结果的分析与判读。本标准适用于对国境口岸蚊类携带的日本脑炎病毒的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求SN/T1552国境口岸生物因子恐怖事件监测规程SN/境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法WS 214　流行性乙型脑炎诊断标准及处理原则WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒)种或样本运输管理规定（卫生部,2006年1月11日）3术语与定义下列术语和定义适用于本文件3. 1日本脑炎 Japanese encephalitis由日本脑炎病毒引起、由蚊传播的中枢神经系统急性传染病，也称流行性乙型脑炎。临床上以突然起病，高热、头痛、呕吐、嗜睡或昏迷、惊厥为特征。4检测对象入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等藏匿和捕获的及口岸区域捕获的蚊虫。5实验室生物安全要求实验室生物安全要求按照GB19489、WS233和SN/T1552执行。6样本菜集、处理与转运样本采集、处理与转运参见WS214、SN/T2300一2009中第7章和附录B以及可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定执行。 SN/T 2772—20117胶体金免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原7.1主要仪器7.1.1生物安全柜。7.1.2可调式微量加样器及塑料尖吸头。7.1.3液氮运输罐、液氮储存罐。7.1.4普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）。7.1.5 玻璃研磨器、研磨棒。7.2主要试剂及其制备7.2. 125 nm胶体金的制备取100mL双蒸水，加热至沸腾。加入1mL新鲜制备的1%的氯金酸溶液加速搅拌，同时加人新配置的1%的柠檬酸钠溶液1.5mL，加热20min直到溶液变成酒红色后冷却，4℃避光保存。7.2.2免疫层析试纸制备免抗日本脑炎病毒 NS1蛋白多克隆抗体标记结束的胶体金溶液以pH为8.2的0.01mo1/LTris溶液（含1%BSA,5%蔗糖)重悬，浸湿结合垫后37℃干燥2h。以浓度为 2 mg/mL的日本脑炎全病毒鼠免疫多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带。以浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，参数0.1 μuL/mm划线，检测线与质控线间距离约为7mm。将吸收垫、样品垫及处理后的结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后切割层析条，宽度每条4 mm，干燥避光保存待用。7.2.3 pH 为 8.2 的 0.01 mol/L Tris 溶液50 mL的0.1 mol/L Tris溶液与 22.9 mL的0.1 mol/L盐酸混匀后,加双蒸水稀释至100 mL,混匀后将上述溶液与双蒸水按 1：4 稀释即为 pH 8.2 的0.01 mol/L的 Tris溶液。7.2. 4 pH 为 8. 0 的 5 mmol/L PB 溶液称取磷酸二氢钠27.8g加双蒸水至 1000mL溶解即为 0.2 mol/L的磷酸二氢钠溶液；称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)53.6 g 加双蒸水至 1 000 mL溶解即为 0.2 mol/I 磷酸氢二钠溶液。取0.2 mol/L的磷酸二氢钠溶液 5.3 mL，取0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液 94.7 mL混匀后加双蒸水按1：19稀释即可。7.2.5样本处理液pH 为8.0 含 1%NP-40 的 5 mmol/L PB溶液。7.3 检测步骤7.3.1将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。7.3.2液氮研磨蚊媒组织成粉末状后加适量（50只批次可加入1 mL)的 pH为 8.0的 5 mmol/L PB液重悬，混匀后