SN_T 2565-2010食品中志贺氏菌分群检测 MPCR-DHPLC法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2565--2010食品中志贺氏菌分群检测MPCR-DHPLC 法Grouping detection of Shigella in food-MPCR-DHPLC2010-12-01实施2010-05-27发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2565—2010.前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局、山东出入境检验检疫局、西藏出入境检验检疫局本标准主要起草人：郑秋月、曹际娟、雷质文、王秋艳、徐杨、于珂、于灵、王长文、赵昕、徐君怡、赤列加措。 SN/T 2565--2010食品中志贺氏菌分群检测MPCR-DHPLC 法 范围1本标准规定了食品中志贺氏菌，包括福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌的MPCR-DHPLC分群检测方法。本标准适用于食品中志贺氏菌，包括福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌的MPCR-DHPLC快速分群检测。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注目期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T4789.5．食品卫生微生物检验志贺氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验3缩略语下列缩略语适用于本文件。3. 1PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应。3. 2MPCR multiplex PCR多重 PCR。3.3DHPLC denaturing high performance liquid chromatography变性高效液相色谱。3. 4TEAA三乙基铵乙酸盐。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行1 SN/T 2565—20105废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403规定执行。6原理MPCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般 PCR相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引；同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙睛的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。7..1 Taq DNA 聚合酶。7.2 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。7.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。7.4引物：引物序列见附录A表A.1。7.5TE溶液。7.6 10% SDS.7.7套蛋白酶K(20 mg/mL)。7.8·盒氯化钠溶液(NaCI)：5mol/L和0.7mol/L。7.9°10% CTAB。7.10‘三氯甲烷。7.11：异戊醇。7.12酚。7.13异丙醇。7.1470%乙醇。7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250uL乙腈混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液B为50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液D为75%乙腈。主要仪器和设备8.1 PCR仪。8.2.DHPLC 仪。8.3高速离心机：离心转速18000g。8.4PCR超净工作台。8.5微量可调移液器和灭菌吸头：2uL，10μL，100uL，200μL，1000μL。2 SN/T 2565—20108.6灭菌PCR反应管。方法提要与检测程序99.1方法提要志贺氏菌属根据生化反应及抗原组成不同，分为A、B、C、D四个血清群（种）。A群为痫疾志贺氏菌，B群为福氏志贺氏菌，C群为鲍氏志贺氏菌，D群为宋氏志贺氏菌。本方法采用MPCR同时扩增志贺氏菌及其四个血清群。MPCR产物再利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，根据DNA扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，从而实现对食品中志贺氏菌进行快速分群检测