SN_T 5138-2019棉花黄萎病菌检疫鉴定方法.pdf

ICS 65. 020. 01B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5138—2019棉花黄萎病菌检疫鉴定方法Detetion and identification of Verticillium dahliae Kleb2019-09-03发布2020-03-01实施中国海司出版社有限公司HG944440010975中华人民共和国海关总署发布刮开徐层微活密码“ 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准棉花黄萎病菌检疫鉴定方法SN/T 5138--2019X中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编辑部：（0107509网址/book中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数22千字2020年3月第一版2020年3月第一次印刷印数1-—500?书号：155175·192 SN/T 5138-2019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国天津海关、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国乌鲁木齐海关、中华人民共和国青岛海关。本标准主要起草人：段维军、郭立新、廖芳、蔡磊、李雪莲、张祥林、王英超、张慧丽、陈先锋。 SN/T花黄萎病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了棉花黄萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于棉花黄萎病菌的检测鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1轮枝状分生孢子梗verticillateconidiophore在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，一般1～5轮，是轮枝菌的分生孢子梗类型。2.2厚垣孢子chlamydospore由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗不良环境的一种休眠孢子。2. 3微菌核microsclerotium由单一菌丝体不断聚集的暗褐色或黑色较为坚硬的休眠体，2. 4休眠菌丝体resting mycelium一种菌丝休眠体，暗褐色或近黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状。3基本信息中文名：棉花黄萎病菌学名：Verticillium dahliaeKleb分类地位：棉花黄菱病菌隶属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌纲（Sordariomycetes）中的小不整球壳科（Plectosphaerellaceae）。传播途径：棉花黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌溉水和昆虫传播。近似种：黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum Reinke and Berthold、三体轮枝菌V.tricorpus I-saac、变黑轮枝菌V.nigrescens Pethybridge、云状轮枝菌 V.nubilum Pethybridge 等。4鉴定原理棉花黄萎病菌的危害症状、形态学特征及分子生物学特征是鉴定该病菌的依据。5仪器和试剂5.1仪器高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、1 SN/T 5138—2019核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空干燥仪、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR仪、凝胶成像仪、微量移液器（0.1L～2.5L，1μL～10μL，10μL～50μL，20μL～200μL，100μL～1000uL）、锥形瓶、试管、培养Ⅲ、载玻片、盖玻片。5.2试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。CTAB提取液（2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/LEDTA，100 mmol/LTris-HCIpH8.0）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、次氯酸钠、RNase、PCR反应试剂：2×TaqManUniversal PCR Master Mix。5.3培养基PDA培养基。6检疫鉴定6.1分离培养挑取感病材料（如植株维管束、种子等），用1.5%次氯酸钠或75%酒精浸泡1min进行消毒处理：无菌水冲洗3次后置于灭菌滤纸，吸干水分后放置于倒有PDA的培养血中。培养Ⅲ倒置在25℃光照培养箱中培养。分离出可疑菌落后转接纯化培养。6.2形态学观察显微镜检孢子的形态特征、产孢方式。在25℃、黑暗条件下，观察记录菌落的生长速度、颜色变化、分生孢子梗和微菌核的形成情况。6.3DNA制备采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法，参见附录A。6.4实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测方法见附录B。7鉴定特征7. 1 症状植株