SN_T 3661-2013口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3661--2013口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测Detection for rotavirus (group A)of foodbrone disease byreal-time fluorescence PCR at ports2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3661—2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国河北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：史玲莉、韩伟、闫冀焕、沈军、王惠兰、董辉、崔鹰1 SN/T 3661—2013口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光 PCR 检测1 范围本标准规定了国境口岸食源性轮状病毒（A组）的荧光PCR快速检测方法，包括标本采集、运输与保存、处理、核酸提取与检测、结果分析以及相应的生物安全措施。本标准适用于国境口岸出人境腹泻患者粪便样本~呕吐物和可疑食品的轮状病毒（A组)筛查检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.1—2003食品卫生微生物学检验总则GB19489实验室　生物安全通用要求SN/T1720—2006　出人境口辈轮状病毒感染监测规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1轮状病毒rotavirus属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒是双链RNA 病毒,基因组分 11 个节段，轮状病毒有 7 齐血清组（A-G),其中 A、B、C组与人类疾病有关,A 组轮状病毒主要引起儿童腹泻，B组轮状病毒主要引起成人腹泻。3.2荧光 PCR fluorescence polymerase chain reaction又称为实时PCR(real-time PCR），是在普通PCR的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放的荧光光能的变化来直接反映PCR扩增产物量变化的技术。.本标准所采用的是TaqMan水解探针法,其原理是在常规RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)的基础上，加入条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR扩增时,利用Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成同步。3.3Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4仪器和设备4.1荧光定量PCR仪。 SN/T 3661—20134.2生物安全柜。4.3普通冰箱(2℃～8℃和一20℃两种)。4.4超低温冰箱(一70 ℃）。4.5低速低温离心机（离心转速≥6 200g）。4.6高速冷冻离心机（离心转速≥13800g，4℃低温）。4.7微量可调移液器（10 μL、100μI、1000μL)及配套带滤芯吸头。4.8 离心管(1.5 mL)。4.9涡旋振荡器。5 试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所用试剂均采用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5.1样本稀释液商品化磷酸盐缓冲液(PBS:Phosphate Buffered Saline)（含 Ca²+、Mg²+）,pH 7.2～7.4。也可参见附录A.3配制。5.2核酸提取试剂选用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAKit试剂盒，德国Qiagan公司产品!，内含AVl、AW1、AW2、AVE等成分。5.3核酸检测试剂迅必达轮状病毒（A组）核酸检测试剂盒，成都新基因格生物科技有限公司产品’。6标本的采集6.1粪便标本采用无菌螺口便盒采集腹泻患者粪便标本，每份标本5mL～10mL，用耐低温油性记号笔在便盒上做好标记，置于一20℃保存。轮状病毒感染者出现症状后1d～3d内粪便排毒量最大，因此应尽可能在此期间收集标本。6.22呕吐物标本需要进行呕吐物中是否含有轮状病毒时，按照SN/T1720-2006中进行采样，置4℃保存并立即送检。6.33可疑食品样本需要调查食品是否被轮状病毒污染时，按照GB/T4789.1--2003中第3章进行采样，置4℃保存并立即送检。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 3661-20137检测方法7.1样本处理和保存7.1.1粪便样本的处理取适量粪便标本加