SN 1377-2004从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1377-2004从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程Protocol of the isolation of equine viral arteritis virus from stallions semen2004-06-01发布2004-12-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局3105615热电片“数码防伪 SN/T 1377--2004前言本标准的附录 A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、王树锋、王丽。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1377—2004从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程1 范围本标准规定了从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验方法。本标准适用于从精液中分离马病毒性动脉炎病毒。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2.1 EAV:马病毒性动脉炎病毒。2.2：MEM:含非必需氨基酸的细胞培养液。3仪器设备3. 1超净工作台或生物安全柜。3.2二氧化碳培养箱。3.3倒置显微镜。3. 4液氮贮存罐。3.5蔡氏滤器和微孔滤膜(0.22 μm)。3.6蒸汽消毒器。3.7微量细胞培养板（96孔）。3.8微型振荡器。3.9可调微量移液器和吸嘴（200 uL）。3. 10 电子天平(0.1 mg～200 g)。3. 11吸管(1 mL.2 mL.5 mL、10 mL)。4 试剂4.1抗生素贮存液。4.27.5%碳酸氢钠溶液。4.3细胞消化液(0.02%EDTA）。4.4标准病毒株和细胞系：一196℃(液氮)冻存备用。4.4.1 标准病毒株;马病毒性动脉炎病毒(Equine Arteritis Virus,EAV)Bucyrus 株。4.4.2细胞系:兔肾细胞(RK-13)。4.5细胞培养液和细胞维持液。4.61%细胞染色液。4.77.5%羧甲基纤维素。5　操作方法5.1精液采集5.1.1准备干净、无菌的采精管（如假阴道、阴茎套）。采精管不得含有防腐剂或消毒剂。★ SN/T 1377--20045.1.2采集精液时可同时采两份，也可在不同时间各采一份，应采集含精子量多的部分（射精中期)作为待检样品进行病毒分离。5.1.3采精后，应立即将含精液的采精管放入碎冰中或冰盒中，尽快送到实验室。如果不能及时送实验室，可将精液暂时冷冻于一20℃以下保存(不超过7d),冷冻精液不影响病毒的分离。5.2病毒分离5.2.1将精液进行预处理，超声波裂解三次，每次 15 s。5.2.2在 4℃下1 000g离心10 min,沉淀精子细胞。5.2.3上清液用维持液做10-1-10-3系列稀释，接种于已长成单层的RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。5.2.4加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层。5.2.5在5%二氧化碳恒温恒湿二氧化碳培养箱中孵育1h。5.2.6加入含0.75%羧甲基纤维素的培养液，再培养。5.2.7培养 2 d～6 d后，在显微镜下观察 CPE情况(细胞圆缩、脱离、裂解）。5.2.8如果不出现 CPE,应盲传一次，即将细胞培养物冻融两次,再接种到单层细胞培养5 d～7 d后，用细胞染色液(工作液为0.1%福尔马林缓冲结晶紫溶液)染色。5.2.9用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。6结果判定检查各种对照试验，细胞对照正常，无 CPE；阳性对照出现明显的 CPE,说明试验成立。如果试验组出现明显的 CPE,表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则判为病毒分离阳性；如果没有明显的 CPE,结晶紫染色后，细胞单层出现细胞壁不完整的死细胞区域，也判为病毒分离阳性。如果分离的细胞培养物能被EAV阳性血清中和或其他方法，则分离的病毒为 EAV。2 SN/T 1377—2004附录A(规范性附录)试剂的配制A.1抗生素贮存液用灭菌蒸馏水配成每毫升含10000IU青霉素和10mg链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜(0.22#m)过滤除菌，分装成2mL/瓶，一20℃冻存备用。保存期不超过60d。A.27.5%碳酸氢钠溶液7.5g碳酸氢钠溶解于100mL蒸馏水，用微孔滤膜（0.22μm)过滤除菌，分装成2mL/瓶，4℃冷藏备用。保存期不超过60d。A.3细胞消化液(0.02%EDTA)EDTA(乙二胺四乙酸二钠:Versense)(A.R.)0.2 g8.0g氯化钠（A.R.）0.2 g氯化钾（A.R.）1.15 g磷酸氢二钠（A.R.）0.2g磷酸二氢钾（A.R.）加双蒸水至1000mL，充分溶解，分装成小瓶，115℃高压灭菌10m