SN_T 3447-2012草莓簇生植原体检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3447-—2012草莓簇生植原体检疫鉴定方法Detection and identification of strawberry multiplier phytoplasma2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3447—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：粟智平、耿金培、张京宣、牟海青、鲁闽、栾晶、王颖。 SN/T3447—2012草莓簇生植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法。本标准适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3. 1聚合酶链式反应polymerasechainreaction在聚合酶的作用下，以DNA为模板、dNTPs为底物、两条反向的引物对为起点，根据碱基配对原则，按照DNA的核苷酸顺序，合成与模板互补的NA链的过程。PCR是一种体外基因扩增技术。3. 2SYBRGreen实时荧光PCRSYBR,GreenrealtimePCRSYBRGreen试剂中含有一种荧光染料，这种荧光染料可以与双链DNA结合而产生荧光，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。在整个PCR反应完成后，会生成一条熔解曲线，峰值的高低可以确定PCR产物的量，单峰表示PCR扩增的强特异性。SYBRGreen实时荧光PCR跟普通PCR引物-样，而不需要另外设计探针。4方法原理4.1分类地位草莓簇生植原体（Strawberrymultiplierphytoplasma）属于植原体16SrI-K亚组。其他信息参见附录A。4.2检测原理本标准检测的主要依据是植原体的基因序列信息。首先，用根据植原体16sRNA基因的通用引物进行PCR扩增，以确定检疫对象是否为植原体；然后，利用两对草莓簇生植原体的特异性引物，通过SYBRGreen实时荧光PCR及电泳检测进行结果判定，确定检疫对象是否为草莓簇生植原体。 SN/T3447—20125仪器设备、用具及试剂5.1主要仪器设备高速冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、常规PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、天平（感量：0.001g）、冷藏冷冻冰箱、旋涡振荡器、高温干燥箱、生物安全柜、水浴锅等。5.2主要用具研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2ul，10uL，20ul，100μl，200μul，1000ul.）、各种吸头(10μL，200μL，1000μL)、离心管（0.2ml,0.5mL，1.5ml，2.0mL）等。5.3主要试剂DNA提取试剂详见附录B;PCR试剂详见附录C;SYBRGreen实时荧光PCR试剂详见附录D。6检测与鉴定6.1引物设计根据草莓簇生植原体16srRNA基因的保守序列，采用了一对植原体通用引物P1，并设计了两对草莓簇生植原体特异性引物P2和P3，具体序列及对应的基因片段长度如下：P1F5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3P1R:5-TGA CGG GCG GTG TGT ACAAAC CCC G-3P1F/P1R对应的PCR产物长度为1.24kb。P2F.5-CGGCGCGCCTAA TACATG-3P2R:5-TCC AGT CTT AGC AGT CAT TTC CAA C-3P2F/P2R对应的PCR产物长度为131bp。P3F:5-AGA CTA TGATGTGTA GCCGGA CTG-3P3R:5-ACG TAC CGAAATACTTCATCA TTC AC-3P3F/P3R对应的PCR产物长度为156bp。6.2DNA的提取试剂及具体步骤详见附录B。6.3通用引物的PCR扩增及电泳试剂及操作详见附录C。6.4SYBRGreen实时荧光PCR及电泳检测若6.3中通用引物扩增出1.24kb左右的PCR产物，则需要进行进一步的特异性PCR试验。试剂及具体操作详见附录D。若SYBRGreen实时荧光PCR检测中结果呈阳性，则需将PCR产物进行进一步电泳观察。试剂及操作详见附录C。2 SN/T3447-