NY 905-2004鸡马立克氏病强毒感染诊断技术.pdf

ICS 11.220B 42NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 9052004鸡马立克氏病强毒感染诊断技术Diagnostic technique for virulent mareks disease virusinfection of chickens2005-02-01实施2005-01-04发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 905—2004前言本标准的附录 A 和附录 B都是规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽技术师范学院。本标准主要起草人：张训海、朱鸿飞、吴延功、张忠诚、陈溥言。T NY/T 905—2004鸡马立克氏病强毒感染诊断技术1范围本标准规定了马立克氏病病毒(Mareks disease virus，MDV)琼扩抗原和MDV琼扩抗体同时检测进行鸡MDV 强毒感染诊断的两种操作方法。本标准适用于鸡马立克氏病(Mareks disease，MD)临诊鉴别诊断、MD流行病学调查、MDV 强毒感染的诊断、鸡群MDV强毒污染监测、产地和口岸检疫。2MD琼脂免疫扩散试验检测技术与方法该技术与方法适用于14日龄以上鸡的羽毛囊（含髓羽毛根或羽液)MDV抗原和30日龄以上鸡的血清或羽髓液中 MDV特异抗体的检测。2.1材料准备2.1.1器材：1mL注射器及9号针头；1.5mL离心管；微量移液器及移液器吸头；尖头眼科摄和手术剪；孔径3mm的打孔器。2.1.2MDV特异琼扩阳性抗原和琼扩阳性抗体：按说明书保存与使用。2.1.3琼脂凝胶平板的制备：见附录B。2.2操作方法2.2.1羽液MDV抗原和抗体的同时检测法羽液样品的制备从被检鸡股胫外侧、胸部和背颈交界处羽区及翅羽,采集较粗大的富含羽髓的羽毛根3根～10根。挤压出羽髓于1.5mL离心管中,离心分离出羽液，作为试样直接检测或置于－20℃下待检。 打孔将已制备的琼脂凝胶平板放在预先画好的如图1所示的7孔梅花型图案上，用打孔器垂直打孔，相邻孔孔边距均为3mm。用9号针头小心剔除孔内凝胶,勿损坏孔的边缘，避免凝胶层脱离平板底部。视琼脂凝胶图 7孔梅花平板面积可同时做多个梅花型孔。型图案封底用酒精灯火焰烧烤该处平板底至约70℃（可以用手腕皮肤感受至不能承受为止），以防样品溶液从孔底侧漏。加样用微量移液器分别在外周中的2号、3号、5号、6号孔，分别加注4份被检样品；向1号、4号孔加注MDV特异琼扩阳性抗体/抗原。向中心孔内加注与1号、4号孔相对应的MDV特异琼扩阳性抗原/抗体。以上孔均以加满不溢出为度。每加一个样品,应更换一个吸头。感作将加样完毕的琼脂板加盖后，随即进行标识与记录，而后将琼脂板轻轻倒置平放在湿盒内，置于37℃温箱中感作,24 h内观察并记录结果。2.2.2羽毛根及血清MDV抗原和血清MDV抗体的同时检测法样品的制备1 NY/T 905—2004被检鸡的羽毛根样品和血清样品应同步采集。.1羽毛根样品：从被检鸡股胫外侧、胸部和背颈交界处羽区或翅羽拔取较细小的富含羽髓的羽毛根，剪下0.5mm长的羽毛根尖，每个试样2根～3根即可，直接用于MDV抗原的检测或置于-20℃下待检。.2血清样品：从被检鸡翅静脉/心脏抽取不少于0.2mL血液,注人1.5mL离心管,待血液凝结后使之自然析出或离心分离出血清,直接用于检测或置于－20℃下待检。羽毛根MDV抗原检测将已制备的琼脂凝胶平板放在预先画好的7孔梅花型图案上，用打孔器垂直打出中心孔。在中心孔周围6个孔的中心,用尖头眼科摄的摄尖或牙签分别垂直插2个～3个紧密的孔眼。每号孔依次插人同一被检鸡2个～3个羽毛根样品。如此,每个中心孔周围可检测6份样。酒精灯火焰封底后,冷却至室温。向中心孔内加注 MDV特异琼扩阳性抗体，以加满不溢出为度。加盖与标记后,将平板倒置平放在湿盒内,置于 37℃温箱中感作,24 h内观察并记录结果。血清MDV抗体的检测操作方法同2.2.1,其区别是在加样时，2号、3号、5号、6号外周孔中依此加注4份被检血清，1号、4号孔加注MDV特异琼扩阳性抗体,向中心孔加注MDV特异琼扩阳性抗原。2.3结果判定及判定标准被检样品MDV抗原和MDV抗体的检测,任何一种出现阳性结果或2种都出现阳性结果,则判被检样品鸡为MDV强毒感染阳性;都呈阴性者,则判为被检样品鸡无 MDV强毒感染。2.3.1被检样品孔或羽毛根与相邻的已知阳性抗体孔或阳性抗原孔之间形成一条清晰的沉淀线,并与已知阳性抗原孔和阳性抗体孔的沉淀线末端相互融合者，则判被检样品为阳性。2.3.2被检样品孔或羽毛根与相邻的已知阳性抗原孔或阳性抗体孔之间都不出现沉淀线，而已知阳性抗原孔和阳性抗体孔之间有明显的沉淀线，则判被检样品为阴性。2.3.3介于阴性、阳性之间者判为可疑,应重新采样复检。若仍为可