SN_T 3989-2014蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3989—2014蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O、刮涂层梵 SN/T 3989—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林大学、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：宋战昀、冯新、王振国、郑腾、刘金华、孟日增、魏春艳、孟庆峰、肖成蕊、王伟利。I SN/T 3989—2014蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范1 范围本标准规定了密蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察、RT-PCR方法、荧光RT-PCR方法。本标准适用于密蜂急性麻痹病的检疫。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3现场检疫3.1蜂群检查对待检的所有蜂群进行箱外观察，观察蜂群的行为是否异常、箱外是否有不正常的虫尸和有残翅的幼蜂爬行等，从中把可疑有病的蜂群挑出来,进一步进行箱内检查。3.2箱内检查提脾观察，主要查看箱内有无异常的拖弃物，蜜蜂是否有行为、形态等方面的异常。封盖是否异常，巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有死幼虫，幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等。3.3个体检查抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死蜂，拉出中肠检查是否有病变症状，若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似患蜜蜂急性麻痹病，及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离场，并采样送实验室进一步确诊4实验室诊断4.1透射电子显微镜观察4.1.1设备透射电子显微镜（放大倍数：30万倍）、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100μL～1000μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL)、水浴锅。4.1.2材料和试剂 PBS。1 SN/T 3989--20三氯甲烷。3%磷钨酸溶液。滤纸。洁净玻璃。铜网。4.1.3样品采集成蜂样品的采集和保存依据GB/T18088，现场检疫对有临床症状的蜂群，用灭菌后的镊子挑取蜂箱内巢脾上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20～30只，分别装人无菌的容器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。无临床症状的蜂群，随机挑取箱内蜜蜂20～30只，分别装人无菌的容器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。幼虫样品的采集和保存依据GB/T18088,有临床症状的蜂群，无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾（不小于 20 cm²），或无菌挑取单个病虫或死虫若干只装人无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存供检测用。无临床症状的蜂群，随机无菌挑取幼虫若干只分别装人无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存，供检测用。4.1.4样品处理患病蜜蜂或幼虫 3～5 只，与 2 mL的 PBS(pH 7.6)混匀,充分研磨,再加人等量的三氯甲烷，匀浆10 min,然后5000 r/min离心10 min,取上清加人等体积的三氯甲烷，在 37℃～40 ℃水浴中振摇10 min，5000r/min离心10 min，上清继续用此法处理2～4次。取上清，15000 r/min离心30min，取上清，35000r/min离心1h，弃去上清，用适量PBS重悬沉淀即为病毒悬液。4.1.5透射电镜观察取病毒悬液，滴一小滴于腊盘上。取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置 3 min～5 min,取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，稍晾干。取2%醋酸铀溶液，滴一小滴于腊盘上。吸附有样品的铜网放置于染液表面（样品与染液接触）,静置 3 min～5 min。取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，白炽灯下晾干。置于透射电子显微镜下观察，观察条件般为加速电压：80kV～100kV，放大倍数：20万～30万倍，观察和记录病毒粒子形态、结构、长度和直径，并拍摄病毒粒子照片。4.1.6结果判定蜜蜂急性麻痹病病毒粒子电镜照片参见附录A。若发现均一的直径为 28 nm～30 nm,呈球型二十面体的病毒粒子,可初步判断为急性麻痹病病毒。若发现长短不一的椭圆形不等轴病毒粒子,长 30 nm～65 nm,宽 22 nm,可初步判断为慢性麻痹病病毒。病毒的进一步确诊，须结合待检样品的现场检疫、生物学特性或分子生物学检测结果进行鉴定。4.2　RT-PCR方法4.2.1设备梯度 PCR扩增仪、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100 μL～1