SN_T 3748-2013柑橘枝瘤病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3748—2013柑橘枝瘤病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Sphaeropsis tumefaciens Hedges2014-06-01实施2013-11-06发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3748—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王卫芳、赵立荣、华丽、冯黎霞、王振华。1 SN/T3748—2013柑橘枝瘤病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中柑橘枝瘤病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境柑橘及其他相关寄主中柑橘枝瘤病菌的检疫鉴定2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2455进出境水果检验检疫规程3检疫鉴定原理根据柑橘枝瘤病菌在寄主上的为害症状、病菌培养性状与形态学特征作为鉴定柑橘枝瘤病菌的依据。柑橘枝瘤病菌的分类地位、分布、为害症状及寄主范围等背景资料参见附录A。4仪器及用具4.1仪器体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、生物培养箱、pH计。4.2用具样品袋、标签、放大镜、镊子、解剖刀、酒精灯、接种针、培养Ⅲ（直径9cm）、烧杯、三角瓶、试管、量简、载玻片、盖玻片、打孔器（直径6mm）。5试剂和培养基95%乙醇、无菌水、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)（每1000mLPDA由200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配制而成）、酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA)（每1000mLPDA中加人4.0mL25%乳酸）。6检疫鉴定方法6.1[口岸现场查验6.1.1抽样口岸现场查验时，按照SN/T2455进行抽样与取样。1 SN/T3748--20136.1.2症状检查重点查验枝条，观察枝条、茎干或及主干是否有肿胀突起或瘤状物，发生枝瘤的部位是否形成大量的芽并萌发丛生大量嫩枝，嫩枝长度是否超过1m，丛生的嫩枝是否形成肿瘤并最终死亡（检查要点参见A.3、图B.1）。将可疑样品带回实验室做进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。6.2实验室鉴定6.2.1直接检验观察记录枝瘤的外部及剖面症状特点，并置于体视显微镜下检查枝瘤组织外部及内部的质地，组织是否木质化，枝瘤内部之间是否有熙色条纹状菌丝体相连。6.2.2分离培养采用组织分离培养法，用95%乙醇对枝瘤表皮下组织表面进行火焰消毒处理，将消毒过的组织切成5mmX5mm小块，放置于酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA，pH4）中，在30℃下分离培养。也可直接挑取枝瘤剖面中的黑色条纹状菌丝体于APDA中分离培养。定期观察，将菌落边缘菌丝体置于新鲜的PDA平板上纯化，用于后续的病菌培养性状和形态学特征观察。6.2.3病菌培养性状观察将纯化的菌株在PDA平板上培养8.d，用火焰消毒打孔器（直径6mm），然后在菌落上打取菌丝体圆片，转接到新的PDA平板上，重复3次，于30℃培养，观察记录菌落的生长速度、颜色变化、分生孢子形成速度等培养性状。6.2.4病菌形态学特征观察选取发病枝条上的幼嫩枝瘤肿结，切取有深褐色粒状分生孢子器的枝瘤组织块，再进行组织切片，置于生物显微镜下镜检；分离纯化得到病菌菌株在PDA平板上产生分生孢子器后进行显微镜检。观察记录分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子的形态大小及排列和着生方式。7鉴定特征7.1病害症状主要表现枝瘤和丛枝，症状的详细描述和图片参见A.3和图B.1。7.2病菌培养性状在30℃温度下，分离物在PDA平板上生长茂盛，培养7d后直径达8.5cm，初期菌落淡黄色，后转为灰绿色。培养4d后即开始产孢，培养7d后分生孢子器布满整个菌落表面并溢出分生孢子团。分生孢子器深褐色，呈颗粒状，成熟后溢出的分生孢子在分生孢子器顶部聚集成团，乳白色、呈黏稠的液滴状。7.3病菌形态学特征分生孢子器产生在皮层上，半埋生，球形至亚球形、深褐色，具孔口，单生或聚生，直径180μm一2 SN/T 37482013220μm。分生孢子器壁由多层长形细胞排列组成，外层细胞壁比内层细胞壁厚。分生孢子梗无色透明，倒梨形至圆柱形，(5μm~10μm)X(3μm5μm），排列在分生孢子器内壁细胞层上。病菌产生大小两种类型的分生孢子，大型分生孢子无色透明至淡黄色，椭圆形至倒卵形，顶部圆基部平，（20μm一34μm）×（6μm~10μm）（酸橙上），31um×4.6μm（夹竹桃上），无隔，偶1隔，但在人工培养条件下0