SN_T 4730-2016菊基腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4730—2016菊基腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Dickeya chrysanthemi2017-07-01实施2016-12-12发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O SN/T 4730—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：易建平、焦彬彬、廖富荣、冯建军、李敏、于翠、印丽萍。 SN/T4730—2016菊基腐病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了菊基腐病菌（Dickeyachrysanthemi)的检疫鉴定方法，本标准适用于进出境种球、花卉和种苗等植物繁殖材料中菊基腐病菌的检疫鉴定。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.10—2010食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T 2122进出境植物及植物产品金疫抽样方法SN/T 2601植物病原细菌常规检测规范3 福菊基腐病菌基本信息学名:Dickeya chrysanthemi (Burkholder et al.1953)son et al. 2005（Gamma-proteobacteria），肠杆菌目（Enterobac-分类地位：变形菌门（Proteobacteria）Y变形菌纲克氏菌属（Dickeya）。teriales）肠杆菌科(Enterobacteriaces.秋克菊基腐病菌的其他信息参见附A4方法原理理生化特性、Biolog测试结果、烟草过敏性反应本标准以菊基腐病菌的为害症状、菌特征鉴定方法以及致病性测试为主要依据制定了菊基腐病菌的检疫5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备超净工作台、天平、Biolog细菌鉴定系统、低温冰箱、光照恒温培养箱、高压灭菌锅。培养血、离心管、微量可调移液器、吸头、手术刀、注射器及针头。5.2主要试剂牛肉浸膏、蛋白陈、琼脂、酵母膏、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、酚红、盐酸精氨酸、葡萄糖、溴酚蓝。6 检测6.1 症状检查按SN/T1157、SN/T2601和SN/T2122的要求取样，检查样品上是否有软腐症状。症状参见附1 SN/T4730—2016录A。6.2 病菌分离取腐烂症状组织进行病菌分离，手术刀切取病健交界处组织少许，70%酒精表面消毒，无菌水洗3次后转入1mL无菌水中，浸泡10min,用接种环蘸取组织浸出液在营养琼脂培养基NA（见附录B)上划线分离，28℃下培养2d～4d后挑取典型菌落，纯化3次后用于后续试验。疑似菌落淡黄色，煎蛋状，中央突起，边缘呈波浪形。鉴定7.1生理生化测定7.1.1革兰氏染色分离物进行革兰氏染色试验，方法见附录C。7.1.2氧化酶试验分离物进行氧化酶试验，方法见附录C。7.1.3产酸试验分离物进行产酸试验，方法见附录C。7.1.4精氨酸双水解反应试验分离物进行精氨酸双水解反应试验，方法见附录C。7.1.5高温生长试验分离物进行高温生长试验，方法见附录C。7.2Biolog测试分离物在NA上培养后转移至BUG培养基（见附录B)上，30℃下培养24h，按照Biolog使用说明,调整分离物菌悬液浊度后加人Biolog GN微孔板或GENⅢ微孔板中，每孔100μL。微孔板30℃下培养18h后用Biolog仪读数，获得测试结果。7.3烟草过敏性反应将分离物约108CFU/mL悬浮液用灭菌注射器针头注人到普通烟草叶片背面表皮下，25℃光照24 h，观察烟草是否呈现过敏性坏死反应。同时接种阳性菌株悬浮液和无菌水分别作为阳性对照和空白对照。7.4致病性测试分离物在NA上28℃培养24h～48h后用无菌水配成108CFU/mL的菌悬液，采用针刺法接种风信子或蝴蝶兰幼苗叶片或马铃薯幼茎，以无菌水作为对照，28℃光照培养，3d后观察叶片发病情况。8结果判定从可疑症状样品中分离得到疑似分离物，经生理生化试验、Biolog测试、烟草过敏性反应和致病性2 SN/T 4730—2016测试Biolog鉴定结果为菊果胶杆菌Pectobacterium chrysanthemi（GN微孔板）或菊狄克氏菌Dickeyachrysanthemi（GEN IⅢI）;生理生化试验结果与 Dickeya chrysanthemi 相符;烟草过敏性反应和致病性测试为阳性,3 个试验均为阳性判