SN_T 3991-2014赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3991—2014赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法Detection of akabane virus with real-time RT-PCR2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局E4.6982131.50m刮涂查真伪 SN/T 3991-—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张吉红、唐泰山、黄素文、李如松、倪健波、王建峰、张常印。I SN/T 3991--2014赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于家畜及其产品中赤羽病毒的检验2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适应于本文件。3.1.1实时荧光 RT-PCR real time RT-PCR在RT-PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个 RT-PCR扩增过程3.1.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.22缩略语下列缩略语适用于本文件。AKAV:赤羽病毒(Akabane virus)DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate)dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)FAM:6-羧基荧光素（6-carboxyfiuorescein)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline)RNA:核糖核酸(Ribonucleic Acid)SDS:十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)TAMRA:6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethane]Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)4仪器和设备4.1荧光定量 PCR核酸扩增仪。1 SN/T 3991—20144.2超净工作台。4.3电子天平。4.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，微型离心机。4.5冷藏冷冻冰箱。4.6组织匀浆器。4.7旋涡震荡器。4.8微量移液器:2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。4.9一70℃低温冰箱。4.10无 RNase玻璃容器、无 RNase 离心管（1.5 mL）、无 RNase 吸头（20 μL、200 μL、1 000 μL）、无RNase PCR薄壁管、无 RNase药匙:见 A.4。5试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。5.1裂解液：Trizol或其他等效裂解液。5.2三氯甲烷：异戊醇：体积分数24：1。5.3异丙醇：一20℃预冷。5.4PBS磷酸盐缓冲液）：见 A.1。5.5无 RNase 水:见 A.2。5.675%乙醇:见A.3。5.710XRT-PCR缓冲液。5.8 ROX reference dye.5.9EX Taq HS.5.10RNase Inhibitor.5.11M-MLV RTase.5.122引物和探针引物和探针序列如下,其中探针的5端标记FAM,3端标记TAMRA。上游引物 AKAV-1:5-CCC CTG GTG CTG AGA TGT TT-3下游弓I物 AKAV-2:5-CTT CCT CAT GAA GTT GAC ATC CAT-3探针 AKAV probe:5-ACC CAC TGG TTA TCG ACA TGC ACC G-36样品的采集和前处理6.1取样工具6.1.1棉拭子、剪刀、镊子、离心管。6.1.2所有上述取样工具应经121℃土2℃,15 min高压灭菌并烘干。6.1.3采样方法6.2　活畜用无菌注射器直接吸取血液至无菌离心管中，编号备用。2 SN/T 3991—20146.3内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于组织匀浆器中，加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转人无菌离心管中3000 r/min离心10min，取上清液转