SN_T 2014-2014番茄黑环病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2014—2014代替 SN/T 2014--2007番茄黑环病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Tomato black ring virus2014-04-09 发布2014-11-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2014—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替 SN/T 2014--2007《番茄黑环病毒检疫鉴定方法》。本标准与 SN/T 2014一2007相比，主要技术变化如下：增加了 IC-RT-PCR 检测方法;增加了附录 A番茄黑环病毒简介。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张裕君、郭京泽、杨翠云、王金成、刘鹏、廖芳、刘跃庭、夏惠娟、罗加凤、于翠。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 2014—2007。 SN/T 2014—2014番茄黑环病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了番茄黑环病毒检疫鉴定的方法。本标准适用于植物种子、苗木、组培苗、无性繁殖材料中番茄黑环病毒的检疫鉴定。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3:番茄黑环病毒基本信息学名: Tomato black ring virus缩写：TBRV分类地位：伴生豇豆病毒科（Secoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。传播途径：该病毒通过线虫（Longidorus attenuatus 和 L.elongatus）传播、机械传播、种子（繁缕和大豆等)传播，也可通过无性繁殖材料的运输远距离传播。番茄黑环病毒的其他信息参见附录A。4原理番茄黑环病毒的生物学特性、血清学特性、分子生物学和粒体形态特性(参见附录 A)是鉴定该病毒的依据。采用DAS-ELISA（双抗体夹心酶联免疫吸附测定）、免疫电镜、RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）、IC-RT-PCR(免疫捕获逆转录聚合酶链反应)技术检测番茄黑环病毒。采用以上技术做出的检测结果，进行综合判定样品是否带有番茄黑环病毒。5仪器设备、设施和用具5.1仪器设备酶标仪、电子天平（1/10 000g）、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量榨汁机、水浴锅、高压灭菌锅、纯水仪、微波炉、磁力搅拌器、研钵研棒、低速离心机、高速冷冻离心机、生物培养箱、低温冰箱和一80℃超低温冰箱。5.2设施隔离检疫温室（10℃～30℃）。5.3用具可调微量移液器（2μL、10 αL、100 μ、200 μL、1000 μL、5000 μL)及配套吸头、酶联板、离心管、研1 SN/T 2014--2014钵、pH计或各范围的pH试纸条、量筒、封口膜、吸水纸、白瓷盘及镊子等。6主要试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法检测试剂（见附录B）、鉴别寄主生物学检测试剂（见附录C）、免疫电镜检测试剂（见 SN/T 1840）、RT-PCR 及 IC-RT-PCR检测试剂（见附录 D）。7番茄黑环病毒检疫鉴定方法7.1 DAS-ELISA 检测具体操作步骤见附录 B。7.2鉴别寄主生物学检测具体操作步骤见附录 C。7.3RT-PCR 及 IC-RT-PCR 检测具体操作步骤见附录 D。7.4免疫电镜检测按照 SN/T1840的规定执行。8 结果判断同时符合下述两项检测结果为阳性的，均可判定待测样品携带番茄黑环病毒：经DAS-ELISA方法检测为阳性；经 RT-PCR方法检测为阳性;经 IC-RT-PCR方法检测为阳性;经鉴别寄主生物学检测为阳性；·经免疫电镜检测观察到病毒粒子;其检测结果为阳性。9记录结果与样品保存9.1记录结果记录实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果应有吸光值的数据报告，生物学检测应有鉴别寄主的典型症状照片，免疫电镜检测应有病毒粒子的照片，RT-PCR 检测和 IC-RT-PCR 检测应有电泳结果照片。9.2样品保存确定携带番茄黑环病毒的样品应在适合的条件下保存,如植物种子 4℃冷藏,病叶、病株在一80℃冰箱中保存或冻干后4℃保存，保存期至少1年。做好登记和标记工作。2 SN/T 2014--2014附录A（资料性附录）番茄黑环病毒简介A.1寄主植物寄主范围：番茄黑环病毒能够广泛侵染单子叶、双子叶草本和木本植物，主要寄主有番茄、黄瓜、辣椒、茄子、韭菜、芹菜、甘蓝、洋葱、莴苣、菜豆、朝鲜蓟、马铃薯、甜菜、芜菁、水仙、唐菖蒲、草莓、繁