SN_T 3756-2013玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法 PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3756—2013玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法PCR 方法Detection and identification of Pantoea stewartii(Smith) Mergaert et al.-PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3756-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009 给出的规则起草。本标准参考了 EPPO PM 7/60(1) Diagnostic protocol for Pantoea stewarti subsp.stewarti---PCR test。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、大连市产品质量监督检验院。本标准主要起草人：王金玲、王有福、贾东、张莹、李俊环、李成镛、贾金生、李炎、刘文博、侯天亮。 SN/T 3756—2013玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法PCR 方法 范围1本标准规定了进境玉米检疫中玉米细菌性枯萎病菌的常规 PCR鉴定方法。本标准适用于进境种用及其他用途玉米中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1375玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法，3玉米细菌性枯萎病菌分类地位学名:Pantoea stewartii(Smith) Mergaert 异名 : Pantoea stewartii subsp.stewartii-Xanthomondss stewartii,?Aplanobacter stewarti ; Bacillus sterertii; Pseudomonas stewartii ;artii; Bacterium stewartii; Phytomongidobucteriumf11Erwinia stewartii分类地位：原核生物界（Procartotae），薄壁菌（Gracilicutes），肠杆菌科（Enterobacteriaceae），泛菌属（Pantoea）。4　方法原理PCR方法的原理：提取细菌基因组:DNA后，利用特异性物,通过 PCR扩增得到特异性目的基因片段，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;依据检测结果判定是香是自的细菌。5仪器设备5.1小型粉碎机。5.2恒温培养箱：30℃±1℃。5.37高压灭菌锅。5.4　PCR扩增仪。5.5PCR超净工作台。5.6 电泳仪。5.7核酸/蛋白分析仪。5.8凝胶成像系统。5.9台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 SN/T 3756—20135.10电子天平（感量0.01g）。5.11 微量加样器(2.5 μL、10 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL)。5.12无菌涂布棒。5.13无菌培养皿:直径 90 mm6 试剂6.1实验用水（应符合 GB/T 6682中一级水的规格）。6.2改良W氏培养基：见附录 A中 A.1。6.33Taq DNA 聚合酶。6.4dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。6.5 10XPCR缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl26.60.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS）（pH值7.2):见A.2。6.7 TE缓冲液(pH 值 8.0):见 A.3。6.8细菌基因组 DNA 提取试剂盒。6.950×TAE缓冲液(pH值8.5):见 A.4。6.10琼脂糖。6.11溴化乙锭。6.12IDNA 分子量标记:100 bp DNA ladder。71PCR 凝胶电泳检测7.1样品处理从待检样品中挑选不成熟、皱缩、有穗轴及色泽较深的籽粒作为检验样品。每份检验样品应不少于0.25kg。待检样品在0.25kg以上、1kg以下的，检验样品可适当减少，但不得低于0.125kg。样品用 0.1%升汞(HgCI)溶液表面消毒处理1 min～2 min,或 3%～5%的次氯酸钠(NaOCl)表面消毒处理5min～15 min，然后用无菌水冲洗3次，无菌条件下晾干。对于药剂拌种的样品，可用 95%乙醇洗去表面药剂后，再用无菌水冲洗3次，无菌条件下晾干。消毒后的种子样品用粉碎机粉碎，称取20g，加人40mLPBS缓冲液（pH7.2)混匀，4℃过夜。7.2病菌分离在无菌条件下取悬浊液1mL，用无菌生理盐水以十倍系列稀释法稀释到1：10000。取每个浓度的稀释液100μL