SC_T 7223.3-2017黏孢子虫病诊断规程 第3部分：武汉单极虫.pdf

ICS 65.020.30B 41SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7223.32017黏孢子虫病诊断规程第3部分：武汉单极虫Protocols for diagnosis of myxosporidiosis-Part 3: Disease caused by Thelohanellus wuhanensis2017-06-12 发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T 7223.3—2017前言SC/T7223《黏孢子虫病诊断规程》拟分为如下部分：第1部分：洪湖碘泡虫；第2部分：吴李碘泡虫；第3部分：武汉单极虫；第4部分：吉陶单极虫。-！本部分为SC/T7223的第3部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由农业部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所。本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。I SC/T 7223.3—2017黏孢子虫病诊断规程第3部分：武汉单极虫1范围本部分给出了鲫(Carassiusauratus）患武汉单极虫病（又称“肤孢子虫病”)的临床症状，规定了武汉单极虫（Thelohanellus wuhanensis）的采集、固定与标本制作，形态学鉴定和分子检测的方法，以及武汉单极虫病的综合判定。本部分适用于鲫武汉单极虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料3.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。3.2乙醇：分析纯。3.3Taq酶：一20℃保存，避免反复冻融。3.4dNTPs：含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L。3.5上游引物：5-CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT-3;下游引物：5-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3”。本对引物扩增核糖体小亚基rRNA基因（18SrDNA)的部分序列。3.6DNAmarker2000(bp):2000、1000、750、500、250、1003.7其他试剂见附录A。4仪器和设备4.1解剖盘、剪刀、镊子、解剖针和解剖刀。4.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。4.3盖玻片、载玻片和培养皿。4.4电子天平。4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6普通冰箱。4.7微量移液器。4.8PCR扩增仪。4.9离心管和PCR管。4.100紫外透射仪或凝胶成像系统。 SC/T 7223.3—20174.11水平电泳系统。5感染对象与临床症状5.1感染对象武汉单极虫感染鲫。5.2临床症状武汉单极虫一般寄生于鲫的体表鳞片下组织和鳍条，寄生于鳞片下的危害较大，可导致鱼苗的死亡。病鱼鳞片被包囊顶起，形成椭圆形凸起。6武汉单极虫的采集、固定与标本制作6.1病鱼采集观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。6.2样品的采集在鳞片隆起处，用镊子取下鳞片，然后将包囊移出，置于培养皿中。6.3样品的固定用10%中性福尔马林溶液（见A.1）固定黏孢子虫包囊团或孢子，或用100%乙醇保存6.4样品的标本制作将黏孢子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液（见A.2），盖上盖玻片，用于显微镜观察。7武汉单极虫的鉴定7.1武汉单极虫形态学鉴定包囊近球形，乳白色，表面有黑色斑点。根据显微镜内的测微标尺测量孢子和极囊的大小，武汉单极虫孢子的形态特征见附录B。成熟孢子壳面观为梨形，缝面观呈厚梭形，前端略尖，后端钝圆，薄膜鞘仅包围孢子后部，壳瓣底部有1个～4个形褶皱；孢子长21.0μm～25.0μm，宽12.0μum～15.0μm，厚10.0um～12.5um；极囊1个，近球形，极囊长9.0um~12.3um，宽7.0μm~9.7um；极丝盘成8圈～10圈。如果孢子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似武汉单极虫。7.2武汉单极虫分子检测7.2.1虫体DNA的提取将用100%乙醇固定的孢子（有包囊的用清水冲洗，去除表面组织）充分干燥去除乙醇，置于1.5mL的离心管中，加人0.5mL裂解缓冲液（见A.6），55℃下过夜。冷却至室温后，加入500μLDNA抽提缓冲液（见A.7），摇匀，5200g离心10min，收集上清液。然后加人0.1倍体积的乙酸钠缓冲液（见A.3）和2倍上清