SN 1396-2004弓形虫病间接红细胞凝集试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1396—-2004弓形虫病间接血凝试验Indirect hemagglutination test for toxoplasmosis2004-06-01发布2004-12-01 实施中华人民共和国510915透0发布数码防伤，国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1396—2004前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国湖北出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：陈建军、郭明星、付文鹏、赵晖等。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1396—2004弓形虫病间接血凝试验1 范围本标准规定了弓形虫病的间接血凝(IHA)试验操作方法。本标准适用于动物弓形虫病的检疫、诊断及抗体水平的检测。2材料和试剂2.196(12×8)孔110°V型血凝板及玻璃盖板。2.2可调式微量移液器及吸头。2.3平板振荡器。2.4弓形虫 IHA诊断液(抗原效价≥1：1024),标准阴性对照血清(效价≤1：4),标准阳性对照血清(效价≥1：1024)。2.5稀释液按附录 A所示要求配制，所用试剂均为分析纯。3采样无菌采动物静脉血液约 1 mL～2 mL,静置自然析出血清或待血液凝固后以 600 g离心分离血清，56℃水浴灭活30min，预冷，用健康公绵羊红细胞（按血清/红细胞体积比约1：1混匀）室温吸附2h（或4℃冰箱过夜），600g离心10min，取上清（要求无血球、无溶血、无杂菌污染），置4℃冰箱备检。4操作步骤4.1取洁净的血凝板，于各孔中加人 75 μL稀释液。4.2取受检血清25uL加人第一列孔中，用移液器反复吹吸混匀，取25μL加人第二列孔，混匀后取25μL加人第三列孔中，如此4倍稀释至第6孔，混匀即1：4096弃去25μL（对于大量样品可只稀释至1：64见表1)。表 1 弓形虫病间接血凝试验操作术式2 34孔号167稀释液空41664血清稀释度(1 ：2561 0244 0961白对照稀释液/μL75 75 ↓7575 .75 75 175 125/ /25/25/~25[2525 弃 25受检血清/μL252525 2525诊断液/μL2525感作22℃~37℃静置 2 h~3 h结果举例(样)++++++++++4.3每次试验须同时作标准阴、阳性血清及稀释液空白对照,标准阳性血清对照应稀释至 1：4 096,标阴性血清对照应稀释至1：64,标准阴、阳性血清稀释方法同受检血清。4.4取弓形虫IHA诊断液（如为冻于制品需按使用说明洗涤稀释后使用），于各检验孔中加人25μL，置振荡器上振荡约1min（或手持血凝板绕圈轻摇至各孔中血球分布均勾），盖上玻璃盖板，22℃～37℃1 SN/T 1396—2004静置约2 h～3 h(当稀释液空白对照呈现“_”时)观察判定结果。5结果判定5.1 判定方法a）100%的红细胞在孔底四周呈均勾、致密的膜样凝集，孔底中央无红细胞沉积，记“+十十+”。b）75%的红细胞在孔底四周呈膜样凝集，有少量未凝集的红细胞沉积在孔底中央呈很小的圆点,记十十+”。50%的红细胞松散的凝集在孔底四周，其余50%未凝集的红细胞沉积在孔底中央呈较大的圆c）点,记“十十”。d)25%的红细胞凝集在孔底四周，其余大部分未凝集的红细胞沉积在孔底中央呈很大的圆点，记十”。e）所有红细胞均不凝集，全部沉积在孔底中央呈规则的最大的圆点，记“一”5.2 判定标准a）以呈现“十十”的血清最大稀释度为该血清的抗体滴度。b)当阳性对照血清抗体滴度不低于1：1024，阴性对照血清各孔均为一”（第一孔允许存在前滞现象“十”）,稀释液空白对照为“一”时，对受检血清抗体滴度进行判定，否则试验不成立。受检血清抗体滴度≥1：64时判为阳性（如表1所示血清抗体滴度为1：64，判为阳性），c）≤1：16判为阴性。 SN/T 1396—2004附录A(规范性附录)稀释液的配制A. tpH7.2,0.15 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS):磷酸氢二钠(Na2HPO4·12HzO)19.34 g磷酸二氢钾(KH2PO)2.86 g氯化钠(NaCl)4.25 g叠氮化钠(NaNs）1.00 g1 000 mL双蒸水(或去离子水)121℃、15 min高压灭菌。A.2无菌取98mL上述 PBS溶液，加人2 mL经 56℃30min灭活的健康兔血清，混匀，4℃下保藏备用。 002960L/NS中华人民共和国出人境检验检疫行业标准弓形虫病间接血凝试验SN/T 1396--2004中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/1