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SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4053—2014鸡传染性贫血检疫技术规范Quarantine protocol for chicken infectious anemia2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电话400698刮涂层查真伪
SN/T 4053—2014前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国东莞出人境检验检疫局。本标准主要起草人:沙才华、杨素、陈轩、许彩芸、梁玉英、王岚、陈进会、徐海聂、罗宝正、廖秀云。1
SN/T 4053—2014鸡传染性贫血检疫技术规范1 范围本标准规定了鸡传染性贫血(CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光聚合酶链式反应(荧光PCR)、间接免疫荧光(IFA)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)的技术要求。本标准适用于鸡传染性贫血的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病毒分离与鉴定3.1试剂改良最低要素营养液(DMEM)培养基,配制方法见A.1。3.1.1i马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系 MDCC-MSB1细胞.3标准阳性血清:用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。3标准阴性血清:无 CIAV感染的 SPF鸡血清.5新生牛血清、青霉素、链霉素。3.2仪器与器材3.2.1二氧化碳培养箱。3.2.2水浴锅。3.2.3普通冰箱及低温冰箱。3.2.4离心机。3.2.5倒置显微镜。微量移液器,容量 2 μI~20 μI,20 μI~200 μL。3.2.6细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2μm微孔滤膜。样品的采集及处理CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、脾脏、胸腺、法氏囊、肾脏和骨髓等组织器官中。无菌采集上述组织,用无血清DMEM制成20%组织悬液,3000r/min离心30min,取上清于70℃处理5min后,加等量10%三氯甲烷室温处理15 min,10000 r/min离心20 min,取上清用于CIAV病毒分离。1
SN/T 4053--20143.4操作方法3.4.1细胞培养用含15%新生牛血清的DMEM培养基在39℃和5%二氧化碳环境下培养MDCC-MSB1细胞。每 2d~3d传代-次,待细胞长至 2×105 个/mL~5×105个/mL时,用于 CIAV病毒分离。3.4.2病料接种将0.1mL处理好的组织悬液接种MDCC-MSB1细胞,在39℃和5%二氧化碳环境下培养48h,观察结果。3.4.3结果观察CIAV感染细胞后,细胞体积增大,随后溶解。若第一次接种未出现细胞病变,将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变,则判为CIAV阴性。3.5CIAV的鉴定出现细胞病变的细胞培养物,用PCR 和荧光 PCR方法进行鉴定。4聚合酶链式反应(PCR))4.1试剂4.1.1除特别说明以外,本标准所用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法的要求,所用试剂均为分析纯。4.1.2DNA提取液(配制方法参见附录B)。4.1.3三氯甲烷(常温保存)。4.1.4异丙醇(使用前预冷至一20℃)。4.1.575%乙醇,采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制,使用前预冷至一20℃。1 mol/I. PBS,pH 7.2(配方见 A.2)。4.1.7TE缓冲液(配制方法见A.3)。4.1.83电泳缓冲液(配制方法见A.4)。4.1.9溴化乙锭溶液(10 mg/ml)。4.1.10CIAV CUX-1标准株 DNA,10 X PCR缓冲液,25 mmol/L 的 MgCl2,10 mmol/L的 dNTPs,5 U/μL 的 Taq DNA 聚合酶。4.1.11选择CIAV特异性VP1基因序列作为CIAV检测的靶序列,产物长度582bp,上游引物和下游引物序列如下:上游引物:5’-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3下游引物:5′-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-34.2仪器与器材4.2.1 PCR 仪。4.2.2紫外成像仪。1)同类的商品化试剂盒适用。2
SN/T 4053—20144.2.3电泳仪。4.2.4高速台式冷冻离心机(可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上)。4.2.5水浴锅。4.2.6生物安全柜。4.2.7 微量移液器,0.1 μL~2.5 μL,1 μl~10 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL,100 μL~1 000 μl并配备与移液器匹配的无DN
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