SN_T 4053-2014鸡传染性贫血检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4053—2014鸡传染性贫血检疫技术规范Quarantine protocol for chicken infectious anemia2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电话400698刮涂层查真伪 SN/T 4053—2014前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国东莞出人境检验检疫局。本标准主要起草人：沙才华、杨素、陈轩、许彩芸、梁玉英、王岚、陈进会、徐海聂、罗宝正、廖秀云。1 SN/T 4053—2014鸡传染性贫血检疫技术规范1 范围本标准规定了鸡传染性贫血（CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、荧光聚合酶链式反应（荧光PCR）、间接免疫荧光（IFA)以及酶联免疫吸附试验（ELISA)的技术要求。本标准适用于鸡传染性贫血的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病毒分离与鉴定3.1试剂改良最低要素营养液（DMEM)培养基，配制方法见A.1。3.1.1i马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系 MDCC-MSB1细胞.3标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。3标准阴性血清:无 CIAV感染的 SPF鸡血清.5新生牛血清、青霉素、链霉素。3.2仪器与器材3.2.1二氧化碳培养箱。3.2.2水浴锅。3.2.3普通冰箱及低温冰箱。3.2.4离心机。3.2.5倒置显微镜。微量移液器,容量 2 μI～20 μI,20 μI～200 μL。3.2.6细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2μm微孔滤膜。样品的采集及处理CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、脾脏、胸腺、法氏囊、肾脏和骨髓等组织器官中。无菌采集上述组织，用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min，取上清于70℃处理5min后，加等量10%三氯甲烷室温处理15 min，10000 r/min离心20 min，取上清用于CIAV病毒分离。1 SN/T 4053--20143.4操作方法3.4.1细胞培养用含15%新生牛血清的DMEM培养基在39℃和5%二氧化碳环境下培养MDCC-MSB1细胞。每 2d～3d传代－次,待细胞长至 2×105 个/mL～5×105个/mL时,用于 CIAV病毒分离。3.4.2病料接种将0.1mL处理好的组织悬液接种MDCC-MSB1细胞，在39℃和5%二氧化碳环境下培养48h，观察结果。3.4.3结果观察CIAV感染细胞后,细胞体积增大,随后溶解。若第一次接种未出现细胞病变,将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变，则判为CIAV阴性。3.5CIAV的鉴定出现细胞病变的细胞培养物,用PCR 和荧光 PCR方法进行鉴定。4聚合酶链式反应(PCR))4.1试剂4.1.1除特别说明以外，本标准所用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法的要求，所用试剂均为分析纯。4.1.2DNA提取液（配制方法参见附录B)。4.1.3三氯甲烷（常温保存）。4.1.4异丙醇（使用前预冷至一20℃）。4.1.575%乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。1 mol/I. PBS,pH 7.2(配方见 A.2)。4.1.7TE缓冲液（配制方法见A.3）。4.1.83电泳缓冲液（配制方法见A.4）。4.1.9溴化乙锭溶液（10 mg/ml）。4.1.10CIAV CUX-1标准株 DNA,10 X PCR缓冲液,25 mmol/L 的 MgCl2,10 mmol/L的 dNTPs,５ U/μL 的 Taq DNA 聚合酶。4.1.11选择CIAV特异性VP1基因序列作为CIAV检测的靶序列,产物长度582bp，上游引物和下游引物序列如下：上游引物:5’-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3下游引物:5′-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-34.2仪器与器材4.2.1 PCR 仪。4.2.2紫外成像仪。1）同类的商品化试剂盒适用。2 SN/T 4053—20144.2.3电泳仪。4.2.4高速台式冷冻离心机（可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上）。4.2.5水浴锅。4.2.6生物安全柜。4.2.7 微量移液器,0.1 μL～2.5 μL,1 μl～10 μL,10 μL～100 μL,20 μL～200 μL,100 μL～1 000 μl并配备与移液器匹配的无DN