SN_T 2685-2010泰勒氏焦虫检疫规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2685—2010泰勒氏焦虫检疫规范Quarantine protocol for Theileriosis2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O数码防伪 SN/T2685—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准是依照SN/T1255一2007《出入境动物检验检疫技术标准编写的基本规定》的要求，参考了OIE《陆生动物手册（2008英文版）》2.4.16章（泰勒氏焦虫病），以及国内外的有关泰勒氏焦虫检疫研究的最新进展进行制定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、西南大学。本标准主要起草人：李应国、聂福平、肖进文、王国民、王昱、聂奎、刘生峰、吴丰春、周启明。 SN/T2685—2010泰勒氏焦虫检疫规范1范围本标准规定了泰勒氏焦虫的病原鉴定、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应检疫技术要求。本标准适用于牛、羊等反台动物及其血液制品中的泰勒氏焦虫的检疫，2规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1678梨形虫病病原鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3. 1泰勒氏焦虫Theileriosia梨形虫纲泰勒科的一种由硬蜱传播的主要感染牛羊和其他野生动物的专性细胞内寄生原虫，主要包括环状泰勒氏焦虫（T.annulata）、小泰勒氏焦虫（T.parva）及瑟氏泰勒氏焦虫（T.sergenti）等。3. 2裂殖体schizont寄生于巨噬细胞和淋巴细胞内进行裂体增殖所形成的多核虫体，也称石榴体或柯赫氏蓝体（Kochsblue bodies)。3.3配子体gametophyte泰勒氏焦虫寄生于外周血红细胞内的特定中间形体，分为逗点形的小配子体和卵圆形的大配子体。4临床诊断4.1发病症状牛、羊等动物体表有蜱寄生或蜱叮咬的痕迹，体温升高，呈稽留热（40℃～42℃），呼吸急促，体态消瘦。4.2病理变化牛、羊等动物的可视粘膜黄染，有出血斑点，体表淋巴结显著肿胀。4.3流行病学本病以硬蜱为传播媒介，通过叮咬传播，具有明显的地域性和季节性。 SN/T2685—20105实验室诊断5.1病原鉴定按SN/T1678规定的方法进行实验和结果判定。5.2间接免疫荧光试验5.2.1设备、材料和试剂5.2.1.1设备低温超速离心机（10000r/min），荧光显微镜、普通光学显微镜，冰箱（4℃、一20℃、一80℃），动物解剖用器械，动物解剖台，微型混合器、振荡器及水平摇床。5.2.1.2试剂和材料丙酮（分析纯），甲醇（分析纯），肝素钠或EDTA，标准阳性血清和阴性血清，由指定单位提供；异硫氰酸荧光（FITC)标记的抗牛（羊）免疫球蛋白抗体，伊文思蓝染液，PBS溶液（pH7.2～pH7.4），固定液（含80%丙酮和0.1%甲醛的PBS），0.2%的叠氮钠，0.4%台盼蓝染色液，50%甘油PBS(pH8.0），试剂配制见附录A。铝箔，干冰或液氮，穿刺针，微量移液器（20μL～200μL），注射器和针头（5mL～10mL），多孔聚乙烯载片（或普通玻璃载片）。5.2.2样品采集5.2.2.1活体动物5.2.2.1.1血液无菌采集牛（羊)静脉血液10mL，加入到已加有0.5mL4%EDTA溶液的抗凝血剂离心管中，并不断摇动离心管，混匀，500r/min离心5min，吸取含有少量红细胞、白细胞的上层血浆。补加少量生理盐水，2500r/min离心10min。取沉淀备用5.2.2.1.2血清无菌采集牛（羊）静脉血液5mL，当日分离血清。将新鲜采集的血液首先在室温自然凝固，置37℃温箱1h，4℃冰箱过夜，待血块全部收缩后分离血清，5.2.2.1.3组织标本无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织，用于组织涂片。5.2.2.2动物户体死亡动物应在其死亡后24h内完成采样工作。采集样品应包括来自蹄冠、耳尖及尾尖的外周血以及大脑皮层、肾、肝、脾和骨髓等脏器5.2.3运输和保存采集的血液样品，若3d内不能运送到实验室，需冷藏方法运送血清，血清于一20℃保存。采集动物户体的样品，需4℃低温保存并迅速运输到实验室。2 SN/T2685—20105.2.4操作步骤5.2.4.1裂殖体抗原的制备5.2.4.1.1裂殖体抗原涂片：培养200mL1000mL的小泰勒氏焦虫或环形泰勒氏焦虫裂殖体感染的淋巴细胞。细胞密度约为10°个/mL，且感染率至少在90%以上。收集细胞，10000r/min，40℃