NY_T 2840-2015猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2840—2015猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法Indirect ELISA for detection of antibodies againstPorcine parvovirus2015-10-09发布2015-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2840-2015前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：陈义平、南文龙、周洁、陆明哲、魏荣一 NY/细小病毒间接ELISA抗体检测方法1范围本标准规定了细小病毒科细小病毒属的猪细小病毒抗体的间接ELISA检测方法。本标准适用于猪细小病毒抗体监测以及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫中华人民共和国农业部公告[2003]第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本文件：PPV：猪细小病毒PorcineparvovirusELISA：酶联免疫吸附试验Enzyme-linked immunosorbent assayOD:光密度optical densityr/min：转/分钟rotationsperminute4试剂4.1猪细小病毒 VP2重组蛋白(re-VP2)克隆猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因，用pET-32a表达载体进行原核表达，亲和层析法纯化重组蛋白。获得的重组蛋白浓度应≥1mg/mL，纯度应≥95%。具体过程见附录A。4.2阳性血清对照选取5月龄健康猪2头，用猪细小病毒疫苗按规定剂量进行免疫，间隔3周免疫2次，第二次免疫1个月后开始采血分离血清，用血凝抑制试验测定其抗体效价。当抗体的血凝抑制效价达到1：1024时采血分离血清，将血凝抑制效价为1：1024的阳性血清用样品稀释液（参见B.4)进行1：50稀释，即为阳性血清对照。4.3阴性血清对照采集无母源抗体、未免疫猪细小病毒疫苗的健康猪血清，经血凝抑制试验检测，结果为猪细小病毒抗体阴性，用样品稀释液（参见B.4)进行1：50稀释，即为阴性血清对照。4.4包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液配制方法分别见B.1、B. 2、B. 3、B. 4、B. 5、B.6、B.7。5器材和设备-次性注射器、恒温培养箱、震荡混匀仪、移液器（200μL、1000μL）、多道移液器（200μL）、酶标板、酶联免疫检测仪等。1 NY/T 2840—20156血清样品的处理6.1血清样品的采集和处理静脉采血，每头猪不少于2mL。血液凝固后分离血清，4000r/min离心10min，用移液器吸出上层血清。6.2血清样品的储存和运输血清样品置一20℃以下冷冻保存。运输时确保低温运送，并及时送达，以防血清样品腐败。按照中华人民共和国农业部【2003］第302号公告的规定进行样品的生物安全标识。7间接ELISA抗体检测操作方法7.1包被抗原以纯化的猪细小病毒VP2重组蛋白（re-VP2)作为包被用抗原，将重组蛋白re-VP2用包被液稀释至3μg/mL，每孔加人100μL（每孔抗原包被量为300ng），37℃包被2h，用洗涤液洗板3次，每次5 min。7.2封闭每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，洗板同上。7.3加待检血清及阳性血清对照、阴性血清对照将待检血清用样品稀释液进行1：50稀释，每孔加入100μL，每板同时设置两孔阳性血清对照、两孔阴性血清对照。当待检血清样品较多时，可根据试验进度，提前进行样品稀释，再一并加样，以确保所有待检样品的反应时间准确、一致。37℃作用1h，洗板同上。7.4加酶标抗体将兔抗猪酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度，每孔加人100μL，37℃作用1h，洗板同上。7.5加底物显色液每孔加人100uL底物显色液，37℃避光显色作用10min。7.6加终止液每孔加入100μL终止液终止反应，10min之内测定OD450值。7.7结果判定在酶联免疫检测仪上读取OD450值，计算阳性血清对照OD450平均值ODp、阴性血清对照OD450平均值ODN。阳性血清对照OD450平均值ODp≥0.5，阴性血清对照OD450平均值OD≤0.2时，试验成立。待检血清样品的OD450≥0.2×ODp十0.8×OD判为阳性，反之判为阴性