SN_T 4823-2017牛凝血因子Ⅺ缺失症巢式PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4823-2017牛凝血因子X缺失症巢式PCR 检测方法Detection method for bovine factor XI deficiency by nested PCR2017-07-21发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局副涂层查真伪） SN/T 4823-2017言前本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：马保华、刘中勇、李贺、贾广乐、吴晓薇、邱索平、朱事康、朱道中、刘志玲、林志雄。T SN/T4823—2017牛凝血因子X缺失症巢式PCR检测方法1范围本标准规定了牛凝血因子X缺失症的巢式PCR检测方法。本标准适用于牛凝血因子X缺失症（参见附录A）的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3缩略语以下缩略语适用于本文件。FXID凝血因子XI缺失症（FactorXIdeficiency）nPCR巢式聚合酶链式反应（Nestedpolymerasechainreaction)ACD酸性柠檬酸葡萄糖溶液PBS磷酸盐缓冲液DNA脱氧核糖核酸dNTP脱氧核糖核苷三磷酸TAE核酸电泳缓冲液4试剂4.1ACD(配制见附录B）。4.2蛋白酶K。4.310%SDS。4.4酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)混合液。4.5无水乙醇。4.6Tris饱和酚。75%乙醇。4.74.8TE缓冲液。4.9PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶。4.10PCR Buffer.4.11dNTP.4.122%的琼脂糖溶液。4.13DNA分子量标记物（Marker)。 SN/T4823-20175仪器与设备5.1高速离心机。5.2恒温水浴锅：保持水温37℃土1℃。5.3微量移液器：1μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,100μL~1000μL。5.4振荡器。5.5pH计。5.6PCR仪。5.7电泳仪5.8凝胶成像仪或紫外透射仪。6样品采集、处理、核酸提取6.17样品采集与预处理按照GB/T18088进行。采血500μL,采集的血样立即与ACD混和均匀，冷藏运输与保存。若血样很快（一个月之内）提取DNA，可将其放于一20℃保存，如果长期保存，可将其放在一80℃。样品避免反复冻融。6.2核酸提取6.2.1将血液样品200μL，加人2mL塑料离心管中，加20μL蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。6.2.2混合液置于55℃，水浴2.5h。6.2.3向匀浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000r/min离心5min。6.2.4吸上层水相800μI于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000r/min离心5min。6.2.5吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min；12000r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液。6.2.6向沉淀中加人75%乙醇溶液500uL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室温凉干。6.2.7向DNA沉淀中加100μLTE缓冲液，溶解沉淀一20℃保存备用。注：DNA提取也可采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行。7巢式PCR7.1巢式PCR扩增引物P1:5-GTGTTGAAGGGTGGAAAAAGTATTCATTG-3P2:5-CTT TGC AGC CCT TCT CCCTTT TTA ATG-3P3:5-GTCGAG TCACCTAAT GTGTTG-3P4:5-CCGTACCTG TGT AAT TCA TTG TC-3引物储存浓度10μmol/L，使用时终浓度为0.2μmol/L。外部引物对（P1、P2)扩增产物长度为540bp(616bp）；内部引物对(P3、P4)扩增产物长度为181bp(257bp）。7.2对照设立从样品处理开始，应设置FXID野生型对照、FXID突变型对照和空白对照。2 SN/T4823—2017空白对照：在扩增反应阶段设置，以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。7.3反应体系采用25uL反应体系，按照表1配制。表 1上下游引物各0.5μL引物（浓度为10pmol/L）2.5 μL10× Pfu