SN 1152-2002鲤春病毒血症病毒（SVCV）逆转录聚合酶联式反应（RT-PCR）诊断方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1152—2002鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测方法Test method of reverse transcription polymerase chainreaction(RT-PCR) for spring viraemia of carp virus(SVCV)2002-11-25 发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1152--2002前言本标准是在总结我国在这一领域的实践经验并参考国际上有关检测规程的基础上制定的。本标准的附录 A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：江育林、高隆英、刘、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1 SN/T 1152—2002鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法1范围本标准规定了细胞分离病毒后，用PCR技术诊断 SVC病毒的方法。本标准适用于 SVC病藓的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696:1987)GB/T18088--2000出人境动物检疫采样3试剂和材料3.1 水应符合GB/T6682-1992中级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提）时所用的水要用DEPC处理以除掉RNA酶。3.2SVC病毒标株3.3 Taq酶一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4逆转录酶AMV10 U/mL。一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5 RNA 抑制剂(RNasin)40 U/μL。-20℃保存，不要反复冻融或度剧烈变化。3. 6 dNTP(含 dCTP,dGTP,dATPdTTP 各 10 mmoL/L)3.7引物该试验选用 SVC病毒的糖蛋白基因作为 PCR的模板。该基因长1 588 bp,在这里用了 2 对引物：F1和R2扩增该基因中的714bp片断，而F1和R4则从该片断中再扩增606 bp片断。所以实际上是“半嵌套式”的PCR(semi-nested PCR)。使用时浓度为40 μmol/L。其序列如下；R2:5-AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC ATH CAN CAY-3*R4:5-CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY TGY-3F1:5-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC-31 SN/T 1152—20023.8无水乙醇分析纯,使用前预冷到20℃。3.9矿物油要求无DNA酶和 RNA酶。4器材和设备4.196孔细胞培养板4.2倒置显微镜4.3恒温培养箱4.4.普通冰箱和低温冰箱4.5组织研磨器．4.6离心机和离心管4.7PCR扩增仪4.8电泳仪4.9微量移液器及吸头4.10紫外观察灯5 SVC 病毒的分离5.1采样对有临床症状的鱼，如是体长小于等于4 cm的鱼苗取整条色，体长4 cm～6cm的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于6 cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。按 GB/T 18088—2000采样。5.2样品处理应在10℃以下。先用组织研磨器将样品勾浆成糊状，再按1：10的最终稀释度重悬于培养液中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品勾浆后再悬浮于含有1000TU/ml青素和1000μg/mL链霉素的培养液中，于 15℃下孵育 2 h～4 h 或 4℃下孵育 6 h～24 h。7000 r/min 离心15 min，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。不必勾浆但需稀释2倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5.3 病毒分离对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1：10,1：100和1：10003个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24h的EPC、CO或者FHM细胞单层中，每孔（2cm²）的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃～20℃吸附0.5h～1h后，加人细胞培养液。置于18℃±2℃培养。试验中要有2孔阳性对照（接种SVC标准株），和空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查