SN_T 2600-2010出境水杉遗传种质资源快速鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2600—2010出境水杉遗传种质资源快速鉴定方法Methods for the rapid identification of Metasequoia glyptostroboidesgenetic resources for export2010-05-27发布2010-12-01实施.中华人民共和国发布这防国家质量监督检验检疫总局 SN/T2600—2010前言本标推按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标推负贵起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。本标准参加起草单位：湖北林业科学院。本标准主要起草人：李金甫、蔡三山、王振华、陈京元、邱国强、靳勇。 SN/T2600--2010引言珍稀植物遗传物种是大自然留给我们的宝贵财富，也是世界各国争夺的珍稀资源。出人境检验检疫机构作为生物物种资源进出境查验的执法部门，迫切需要准确、快速的生物物种鉴定技术，提高口岸查验工作的效率，切实保护我国生物物种资源。本标准应用分子生物学技术，通过有关资料的收集和实验室检测验证，建立了国家一级重点保护植物水杉(Metasequoiaglyptostroboides）的准确、快速的鉴定方法，解决对水杉实施口岸查验的关键技术问题，提高查验效率，有效避免水杉遗传种质资源的流失。1I SN/T2600—2010出境水杉遗传种质资源快速鉴定方法1范围本标准规定了水杉（Metasequoiaglyptostroboides）遗传种质资源的鉴定方法。本标准适用于在对出境水杉遗传种质资源进行查验时，对其进行鉴定。2术语、定义和缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1.1内转录间隔区internaltranscribedspacer，ITs植物细胞核中，编码rRNA的基因是一些高度重复序列组成的多基因家族，其中，编码核糖体小亚基rRNA的18S基因与5.8S、26S基因共同构成一转录单位（见图1）。其中，5.8S与18S、26S间的基因间区分别为内转录间隔区（ITS)1和2。亦即，ITS区被5.8S分隔成ITS1和ITS2两个区域。ITS1和ITS2的转录物在rRNA加工的过程中被切掉，但这两部分在核rRNA成熟过程中具有重要作用。ITSI18s Nuclear rDNA5. 85 rDNAITS226s Nuclear DNAiTS Region图 1 ITS区域结构2. 1. 2聚合酶链式反应poiymerasechainreaction，PCR模板DNA序列经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板DNA序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。2.2缩略语下列缩略语适用于本文件。2.2.1DNAdeoxyrihonucleic acid脱氧核糖核酸。2.2. 2dNTPdeoxyribonucleoside triphosphate脱氧核脊酸三磷酸。2.2. 3dATP deoxyadenosine triphosphate脱氧腺苷三磷酸。 SN/T2600—20102.2.4dCTP deoxycytidine triphosphate脱氧胞苷三磷酸。2.2.5dGTPdeoxyguanosine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸。2.2.6dTTP deoxythymidine triphosphate脱氧胸苷三磷酸。2.2.7dUTPdeoxyuridine triphosphate脱氧尿苷三磷酸。2.2.8bp base pair碱基对。3原理水杉（Metasequoiaglyptostrolbides）属于裸子植物门（Gymnosperm）杉科（Taxodiaceae）水杉属（MetasequoiaMikiexHuetChen）。水杉叶、果、种子具有区别于其他物种的特征。核rDNA的内转录间隔区ITS序列包含被5.8SrDNA-所分隔的-ITS-和-IFS2-两个片段；每个物种具有其特定的ITS序列。水杉叶、果、种子的形态以及ITS序列PCR特异疫应等特征是该物种的鉴定特征。4试剂和材料下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。4.1三氯甲烷，异戊醇，CTAB，液氮，EDOTA4.2dNTPs，TagDNA聚合酶，脂糖Miew染料，DN子量标推，电泳载样缓冲液。5主要器械和设备液氮罐，PCR仪，电泳仪，台式微量离机凝胶成像系统，超净工作台，纯水器，水浴锅，各式微量移液器（0.5μ~1000μL），各式枪头（