SN_T 4629-2016检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4629—2016检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范Preparation,preservation and management specification for nucleic acid ofquarantine pest voucher specimens2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4629-2016言前本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：宋云、陈岩、吕继洲、赵文军、吴绍强、朱水芳I SN/T 4629—2016检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范1范围本标准规定了检疫性有害生物凭证标本核酸保存与管理的要求。本标准适用于检疫性有害生物凭证标本核酸保存与管理。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1凭证标本 voucher specimens具有完备的采集、鉴定信息（采集人、日期、地点、生境、鉴定人、种名等），用于物种复核、引证、溯源并永久保存的标本。3.2nucleic acid核酸核酸分子分为两类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA），是细胞内携带遗传信息的物质。4核酸的处理4.1常用设备针对不同来源的材料和样品采用不同的处理方法，常用设备参见附录A。4.2核酸来源对于昆虫、真菌、线虫、细菌、病毒、杂草,核酸来自于有害生物个体或纯培养，病毒及植原体及难养细菌来自于染病植物材料。4.3核酸提取4.3.1核酸的释放机械法包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解、液氮研磨和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎。1 SN/T 4629--20化学法在一定的pH环境下，加人表面活性剂或强离子剂（CTAB、SDS等）使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀，核酸从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不降解。酶法通过加人溶菌酶或蛋白酶(如蛋白酶K)使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。4.3.2核酸的分离纯化酚/氯仿抽提法细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加人等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加人醋酸钾或醋酸钠,形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多1余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。固相抽提法因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。固相抽提方法的固相支持物有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、磁性颗粒、阴离子交换载体等，在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到固相支持物而与其他生物分子分离。4.4核酸的质量检测完整性检测：通过凝胶电泳检测 DNA 为明亮单一的条带:RNA 为 28 s（23 s）、18 s（16 s）、5.8 s(5 s)三条清晰的rRNA条带，且28 s与18 s条带亮度比值约2：1。纯度检测:DNA:OD260/OD280 在1.7 ～1.9 之间;RNA:OD260/OD230 在1.9～2.1之间。浓度检测：核酸浓度不少于100 ng/μL，体积不少于100 μL。符合上述要求的核酸可用于进一步保存，否则需重新提取。核酸提取过程中采取防止交叉污染措施，并符合SN/T1193的要求。4.5保存4.5.1保存管使用在一80℃条件下专用的冻存管保存。RNA要求离心管DEPC处理过。4.5.2标签：利用透明的可在一80℃不脱落的标签，标签内容：样品编号（Sample ID），采集编号（CollectionNumber),科中文名(Chinese Name of family)，科拉丁名（Latin Name of Family)，属中文名（ChineseName of Genus），种中文名（Chinese Name of Species），保存时间，含量，鉴定人，单位，联系方式。4.5.3保存盒统一使用100管/盒的纸盒保存，保存盒分为昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫及杂草几类，在盒子侧面贴标签，标签包含种类名称。2 SN/T 4629-20164.5.4保存条件每个样品4种保存方式：一20℃保存；一80℃保存；液氮保存；冻干粉状态保存；每种保存方式的样品不少于10管。冰箱带锁并具有断电或温度异