水产动物病毒常用的检测方法.pptxVIP

水产动物病毒常用的检测方法;目前水产动物病毒病尚无有效;目前国内外病毒水产动物病的诊断方法的方法大致可分为 5类: 组织病理学检测技术； 细胞培养技术； 免疫学检测技术； 分子生物学检测技术； 快速检测试剂盒检测技术。;组织病理学检测技术主要借助于光学和电子显微镜，而电镜技术在病毒学研究中应用最多。把水产动物病变组织经过处理，如切片、涂片、压片后，配合适当的染色技术，再用普通光镜和电镜观察其组织病理变化，检测组织细胞的病理变化以及观察包涵体的存在与否等。;斑节对虾杆状病毒（MBV）的感染部位是肝胰腺和肠道上皮细胞核，HE染色可发现细胞核内出现嗜酸性、大小不等的圆形包涵体。其它方法如革兰氏染色法、孔雀石绿液染色亦可快速检验出包涵体。;免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。 单克隆抗体(单抗)技术的发展，大大提高了免疫学技术的特异性和敏感性，常用鱼类病毒的检测和鉴定的免疫学技术有:中和实验、免疫沉淀、免疫电泳、血凝试验、免疫荧光、酶联免疫吸附试验技术等。;分子生物学技术是检测病毒核酸的方法。 它主要目标是识别病毒基因片段，包括PCR、实时荧光定量PCR、核酸杂交、依赖核酸序列的扩增技术、LAMP 等。;（1）核酸探针法 核酸探针是指被某种物质标记了的、从而可被探测到的核酸片段，它能特异性地与待检测核酸样品中的特定DNA 发生反应。 核酸探针法具有快速、准确、灵敏、操作简单、不需要昂贵的实验设备、易于大量制备等优点。因标记物的不同，核酸探针可分为放射性核酸探针和非放射性核酸探针。放射性核酸探针含有放射元素（一般是 32P、3H、35S），非放射性核酸探针则含有非同位素标记物，如地高辛、生物素等。非放射性核酸探针完全克服了放射核酸探针危险、有效期短等缺点，在灵敏度上也近于放射性核酸探针。;（2）聚合酶链式反应（PCR） PCR 技术检测首先是提取样品中的病害动物的DNA，然后加 入特异性的引物，用PCR 仪大量扩增病毒DNA 片断，最后通过凝胶电泳检查扩散增产物，以判断样品???是否有病毒存在。具有敏感性及特异性高、简单、快速等特点，已广泛应用于对虾白斑综合症病毒（WSSV）的检测。应用逆转录多聚酶链式反应（RT- PCR）方法检测可以检测到组织中极微量的病毒RNA，是目前应 用最多、最有效的诊断方法。;（3）实时荧光定量PCR 实时定量PCR 是指在PCR 扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来实时测定特异性产物的量。实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于检测鱼类病毒，如检测石斑鱼病毒性神经坏死病病毒（ NNV）、传染性胰脏坏死病毒（IPNV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）等病毒。;（4）随机扩增多态性DNA 技术（RAPD） RAPD 技术是建立在PCR 技术基础上的新的分子标记技术。其基本原理是采用随机合成的较短的单个随机引物，对病毒或其他生物基因DNA 进行PCR扩增。将PCR产物进行凝 胶电泳形成病毒核酸指纹图谱，不仅可以检测同种病毒，还可以进行不同种病毒间DNA 序列的同源性比较。;（5）LAMP 技术 LAMP 技术是环介导恒温扩增技术的简称，由Notomi 等在 2000 年建立的一种新颖的核酸扩增方法。LAMP操作简便，只要将检测样品（靶核酸）和试剂一起放入 65℃环境中，大约 1h就可以判断扩增与否，适用于现场、快速检测大量样本的水产动物病原体。;（6）核酸杂交技术 核酸杂交是利用特异性标记的DNA 或RNA 作为指示探针，使 其与病原体核酸中互补核苷酸序列进行杂交，以准确检测核酸样品中的特定基因序列，从而确定宿主是否携带有某种病原体。或者直接在取样组织切片上进行原位杂交，确定病原在组织、细胞内外的分布，进而对病原的感染途径进行分析。;水产养殖苗种检疫和养殖动物的病毒 期检测和诊断是最重要的防治手段 。因此 ，建立病毒快速检测技术 ，能快速诊断病因 、及时预测病毒病的发生 ，防止病毒传播和减少经济损失 。在免疫学和;表6-4 我国已研制、开发的部分水产动物病毒快速检测试剂盒试剂盒