2019-nCov核酸实验室的检测流程.pdfVIP

2019-nCov 核酸实验室的检测流程 SICOLAB 一、核酸检测前的生物安全防护（工作人员个人三级防护的穿戴 1、穿戴流程： 在基因扩增实验室的清洁区（更衣区）或者普通实验室的洁净区，工作人员按顺序依 次穿戴好一次性帽子、医用 N95 口罩、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防 护目镜和双层乳胶手套，进入样本处理工作区域或实验室。 2、要点提示： 2.1、具备标准基因扩增布局条件的实验室，应在清洁更衣区做好个人三级防护，条 件有限的实验室亦可选择在一洁净的实验室中按流程穿戴好个人三级防护。 2.2、需佩戴医用N95 口罩，若无医用N95 口罩，可以考虑用普通N95/KN95 口罩外加 一次性外科口罩的组合方式，但不要佩戴有呼吸阀的 N95 口罩。 2.3、佩戴N95 口罩时需检查密闭性，通过双手按压、深呼吸、左右转头等动作严格 检查口罩是否佩戴正确。 2.4、一次性防护服已具备新型冠状病毒核酸检测的防护需求，有条件时可以考虑加 穿一次性反穿隔离衣，穿衣时需由他人协助。 2.5、穿戴整齐的工作人员，应按要求尽快进入样本处理的实验区域开展工作，严禁 穿戴三级防护后再进入普通实验区域或办公区域。 二、样本的灭活处理 1、操作流程： 两名完成三级防护的工作人员，进入样本处理区或样本处理专用实验室，将接收到的 样本二级包装在安全柜内打开，检查样本主容器是否为严格密闭；对密封袋表面进行消毒 后，对送检样本进行 56℃下 30 分钟的灭活，灭活后的样本管需在生物安全柜内打开最内 层的容器，将拭子保存液混匀后进行分装和用于核酸提取。 2、要点提示： 2.1、涉及高致病性病原微生物的实验室活动，需由两名工作人员完成，其中一人负 责主要实验操作，一人提供必要的协助。主操作者应避免反复多次进出安全柜。 2.2、灭活形式：可以采用水浴或空气加热形式完成灭活，采用空气加热时可适当延 长灭活时间。有条件时可以采用小型化设备在安全柜内操作，减少样本进出安全柜的次 数。灭活前的样本严禁在生物安全柜外打开和操作。 2.3、应特别检查采样管是否拧紧、有无样本溢漏等情况。 2.4、样本管每次进出安全柜均需对外表面进行消毒。 2.5、应就近配备适量的消毒处理物品，以防止实验操作过程中可能发生的意外溢洒 事故，有条件时建议在安全柜内配备一次性吸水台布。 三、样本的核酸提取 1、手工核酸提取操作流程（以凯杰的 52906 柱提法核酸提取试剂盒为例 1.1、裂解液配制：在基因扩增实验室的试剂配制区或单独的普通试剂配制实验室 中，准备核酸提取所需的洗液 1 （AW1）、洗液2 （AW2）和carrier RNA。按照要求，分别 向洗液 1 和洗液 2 中加入分子生物学级别的 130ml 和 160ml 的无水乙醇并及时做好标记； 取 310 μl 洗脱液（AVE）溶解310 μg/支的 Carrier RNA。配置好后，通过传递窗进入核酸 提取区或由工作人员送入核酸提取专用实验室。 1.2、样本裂解：取 560 μl AVL 裂解液到 1、5ml 无菌 EP 管中，加入 5、6 μl 配制好 的Carrier RNA，再加入已经灭活的 140 μl 样本（例如咽拭子、血浆等），混匀振荡 15 秒，室温静置 10 分钟，充分裂解样本中的核酸。将 EP 管瞬时离心后加入 560 μl 无水乙 醇，充分混匀 15 秒，再次瞬时离心后备用。吸取 630 μl 裂解产物，小心加入至离心柱 中，8000rpm （或6000g）离心 1 分钟，转移离心柱至新收集管，将剩余 630 μl 裂解产物 加到离心柱中，重复上一离心操作（若样本体积大于 140 μl，则在此步骤重复将 630 μl 裂解产物过滤收集在一个离心柱上）。 1.3、核酸的洗涤：取 500 μl 洗液 1 （AW1）至离心柱中，8000rpm （或6000g）离心 1 分钟；换新收集管后，取 500 μl 洗液 2 （AW2）至离心柱中，8000rpm （或6000g）离心 1 分钟；换新收集管后，用 14000rpm （或20000g）离心3 分钟，去除洗液 2 （AW2）；换新 收集管后，继续用离心机最大转速（20000g）离心 1 分钟，充分甩离残留的洗液 2 （AW2）。 1.4、核酸的洗脱和回收：取一 1、5ml