2019-nCov核酸实验室的检测流程.docVIP

PAGE 2 2019-nCov核酸实验室的检测流程SICOLAB 一、核酸检测前的生物安全防护（工作人员个人三级防护的穿戴） 1、穿戴流程： 在基因扩增实验室的清洁区（更衣区）或者普通实验室的洁净区，工作人员按顺序依次穿戴好一次性帽子、医用N95口罩、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防护目镜和双层乳胶手套，进入样本处理工作区域或实验室。 2、要点提示： 2.1、具备标准基因扩增布局条件的实验室，应在清洁更衣区做好个人三级防护，条件有限的实验室亦可选择在一洁净的实验室中按流程穿戴好个人三级防护。 2.2、需佩戴医用N95口罩，若无医用N95口罩，可以考虑用普通N95/KN95口罩外加一次性外科口罩的组合方式，但不要佩戴有呼吸阀的N95口罩。 2.3、佩戴N95口罩时需检查密闭性，通过双手按压、深呼吸、左右转头等动作严格检查口罩是否佩戴正确。 2.4、一次性防护服已具备新型冠状病毒核酸检测的防护需求，有条件时可以考虑加穿一次性反穿隔离衣，穿衣时需由他人协助。 2.5、穿戴整齐的工作人员，应按要求尽快进入样本处理的实验区域开展工作，严禁穿戴三级防护后再进入普通实验区域或办公区域。 二、样本的灭活处理 1、操作流程： 两名完成三级防护的工作人员，进入样本处理区或样本处理专用实验室，将接收到的样本二级包装在安全柜内打开，检查样本主容器是否为严格密闭；对密封袋表面进行消毒后，对送检样本进行56℃下30分钟的灭活，灭活后的样本管需在生物安全柜内打开最内层的容器，将拭子保存液混匀后进行分装和用于核酸提取。 2、要点提示： 2.1、涉及高致病性病原微生物的实验室活动，需由两名工作人员完成，其中一人负责主要实验操作，一人提供必要的协助。主操作者应避免反复多次进出安全柜。 2.2、灭活形式：可以采用水浴或空气加热形式完成灭活，采用空气加热时可适当延长灭活时间。有条件时可以采用小型化设备在安全柜内操作，减少样本进出安全柜的次数。灭活前的样本严禁在生物安全柜外打开和操作。 2.3、应特别检查采样管是否拧紧、有无样本溢漏等情况。 2.4、样本管每次进出安全柜均需对外表面进行消毒。 2.5、应就近配备适量的消毒处理物品，以防止实验操作过程中可能发生的意外溢洒事故，有条件时建议在安全柜内配备一次性吸水台布。 三、样本的核酸提取 1、手工核酸提取操作流程（以凯杰的52906柱提法核酸提取试剂盒为例） 1.1、裂解液配制：在基因扩增实验室的试剂配制区或单独的普通试剂配制实验室中，准备核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分别向洗液1和洗液2中加入分子生物学级别的130ml和160ml的无水乙醇并及时做好标记；取310μl洗脱液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通过传递窗进入核酸提取区或由工作人员送入核酸提取专用实验室。 1.2、样本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml无菌EP管中，加入5、6μl配制好的Carrier RNA，再加入已经灭活的140μl样本（例如咽拭子、血浆等），混匀振荡15秒，室温静置10分钟，充分裂解样本中的核酸。将EP管瞬时离心后加入560μl无水乙醇，充分混匀15秒，再次瞬时离心后备用。吸取630μl裂解产物，小心加入至离心柱中，8000rpm（或6000g）离心1分钟，转移离心柱至新收集管，将剩余630μl裂解产物加到离心柱中，重复上一离心操作（若样本体积大于140μl，则在此步骤重复将630μl裂解产物过滤收集在一个离心柱上）。 1.3、核酸的洗涤：取500μl洗液1（AW1）至离心柱中，8000rpm（或6000g）离心1分钟；换新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至离心柱中，8000rpm（或6000g）离心1分钟；换新收集管后，用14000rpm（或20000g）离心3分钟，去除洗液2（AW2）；换新收集管后，继续用离心机最大转速（20000g）离心1分钟，充分甩离残留的洗液2（AW2）。 1.4、核酸的洗脱和回收：取一1、5ml无菌EP管，将离心柱放入其中，加入洗脱液（AVE）40~60μl，室温静置1分钟后，用8000rpm离心1分钟回收核酸，以备PCR检测使用。 1.5、要点提示： （1）、新鲜裂解液的配制应尽可能在专门的洁净区域或单独的实验室进行。 （2）、要用分子生物学级别的无水乙醇试剂进行配制。 （3）、向离心柱中加入裂解产物、洗液时操作要非常小心，尽量将洗头下探到离心柱内部后靠管壁加样，切忌出现溢洒后污染到离心柱的密封圈，这可能会导致乙醇残留，抑制后续PCR反应。 （4）、从离心机中取出离心柱时应小心操作，避免离心柱下缘被收集管中的滤过残液污染。 （5）、加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速离心非常关键，能帮助充