DB35T 1500-2015水禽禽1 型副黏病毒病诊断技术.docxVIP

ICS 11.220 B 41 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1500—2015 水禽禽 1 型副黏病毒病诊断技术 Diagnostic protocol of disease caused by avian paramyxovirus type 1 in waterfowl 2015-02-28 发布 2015-06-01 实施 福建省质量技术监督局 发 布 I DB35/T 1500—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人： 傅光华、黄瑜、白泉阳、施少华、程龙飞、傅秋玲、万春和、陈红梅、彭春香、 吴波平、陈珍。 1 DB35/T 1500—2015 水禽禽 1 型副黏病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭(鹅) 禽1型副黏病毒病的临床诊断要点及强毒株与低毒力株鉴别诊断的反转录- 聚合酶链式反应(RT-PCR)的操作技术规程。 本标准适用于不同品种鸭(鹅)的禽1型副黏病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 16550 新城疫诊断技术 3 疫病概述 禽1型副黏病毒， 又称为新城疫病毒， 该病毒仅有一个血清型， 可感染大多数的禽类， 包括鸡、鸭、 鹅和鸽等， 引起禽类发病率和死亡率的高低与毒株的致病力和感染宿主的种类、日龄及其机体免疫抵抗 力等因素有关，且家养水禽(鸭、鹅)发生禽1型副黏病毒病时，其临床剖检病变有别于鸡新城疫。 4 临床诊断 4.1 临床症状 当鸭、鹅出现以下部分或全部症状时，可作为初步诊断的依据之一： a) 出现扭颈、侧翻、角弓反张、腿麻痹/瘫痪或共济失调等神经症状； b) 产蛋母鸭(鹅)出现产蛋异常； c) 腹泻或呼吸道症状。 4.2 剖检病变 当鸭、鹅出现以下肉眼可见的剖检病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 胰腺散布针尖状白色坏死点或(和)出血点； b) 脾脏肿大，表面有白色坏死点(灶)(适用于鹅)； c) 消化道粘膜有局灶性出血或坏死、溃疡、结痂； d) 脑组织出血或充血。 4.3 实验室确切诊断 当鸭、鹅出现4.1的临床症状之一或4.2的剖检病变之一时，应进行实验室确切诊断。 5 样品采集与处理 2 DB35/T 1500—2015 5.1 样品采集 对于发病鸭(鹅) 群， 采集的样品为发病鸭(鹅) 咽喉棉拭子和泄殖腔棉拭子， 泄殖腔棉拭子需带 有粪便； 采集雏鸭(鹅) 泄殖腔棉拭子较为困难时， 可收集其新鲜粪便代替。对于病死鸭， 则采集胰腺、 脾脏及脑组织。 5.2 样品处理 采集的样品置于样品保存液中，其中组织和咽喉棉拭子的样品保存液配制方法见附录A.1.2； 泄殖 腔棉拭子(或粪便)样品保存液的配制方法见附录A.1.3。 磨碎的组织或粪便与含抗生素的PBS按1:4的比例制成悬浮液，棉拭子则置于2 mL含抗生素的PBS中 充分振荡。上述样品在37 ℃作用60 min或4 ℃作用12 h，棉拭子在反复挤压后弃去。 6 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)诊断以及强毒株与低毒力株的鉴别 6.1 主要仪器设备 6.1.1 PCR 仪。 6.1.2 高速台式冷冻离心机。 6.1.3 生物安全柜。 6.1.4 微量移液器。 6.1.5 组织匀浆器。 6.1.6 电泳仪。 6.1.7 电泳槽。 6.1.8 紫外凝胶成像系统。 6.2 试剂 6.2.1 RNA 提取试剂 Trizol。 6.2.2 三氯甲烷。 6.2.3 异丙醇。 6.2.4 焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理水：配制方法见附录 A.3。 6.2.5 75％乙醇： 用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制， -20 ℃预冷。 6.2.6 商品化的、经过操作者检验合格的一步法 RT-PCR 试剂盒。 6.2.7 溴化乙锭：见附录 A.4。 6.2.8 1×TAE 缓冲液：见附录 A.5。 6.2.9 1％琼脂糖凝胶：见附录 A.6。 6.2.10 DNA 相对分子质量标准物 Marker： DL2000。 6.2.11 10×加样缓冲液：见附录 A.7。 6.3 引物 参见附录B。 6.4 试验步骤 6.4.1 样品核酸的提取 3 DB35/T 1500—2015 6.4.1.1 对于样品核酸的提取按 6.