DB35T 1280-2012大豆疫霉菌分子检测技术规程.docxVIP

ICS 65.020 B16 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1280—2012 大豆疫霉菌分子检测技术规程 Standard protocol for molecular detection of Phytophthora sojae 2012 - 11 - 02 发布 2013 - 02 - 01 实施 福建省质量技术监督局 发 布 福 建 省 地 方 标 准 大豆疫霉菌分子检测技术规程 DB35/T 1280—2012 * 2013 年 1 月第一版 2013 年 1 月第一次印刷 I DB35/T 1280—2012 目 次 前言 III 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 原理 1 5 材料与试剂 1 5.1 主要仪器与器材 1 5.1.1 PCR 检测仪 1 5.1.2 凝胶成像仪 2 5.1.3 台式离心机 2 5.1.4 涡旋混匀器 2 5.1.5 电泳仪 2 5.2 主要试剂 2 5.2.1 苯酚；氯仿；异戊醇；乙醇 2 5.2.2 二甲基亚砜 2 5.2.3 氢氧化钠 2 5.2.4 脱脂奶粉 2 5.2.5 PCR 常规试剂 2 6 采样 2 6.1 采样工具 2 6.2 样品采集 2 6.2.1 大豆植株 2 6.2.2 土壤 2 6.3 样品贮运 2 6.4 样品存放 2 7 操作方法 2 7.1 样本 DNA 制备 2 7.1.1 植物组织中病原菌 DNA 的提取 2 7.1.2 土壤中 DNA 的提取 3 7.1.3 DNA 的保存 3 7.2 检测 3 7.2.1 加样 3 7.2.2 PCR 检测 3 7.2.2.1 反应体系 3 7.2.2.2 反应条件 3 II DB35/T 1280—2012 7.2.3 套式 PCR 检测 3 7.2.3.1 套式 PCR 模板 DNA 制备 3 7.2.3.2 套式 PCR 反应体系 3 7.2.3.3 套式 PCR 反应条件 4 7.3 琼脂糖凝胶电泳 4 8 结果判定 4 8.1 PCR 检测结果判定 4 8.2 套式 PCR 结果判定 4 9 样品处理 4 附录 A(资料性附录) 大豆疫霉菌样本检测报告 5 附录 B(资料性附录) 大豆疫霉 PCR 检测试剂 6 III DB35/T 1280—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的要求编写。 本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：陈庆河、翁启勇、李本金、兰成忠、赵健、邱荣洲。 1 DB35/T 1280—2012 大豆疫霉菌分子检测技术规程 1 范围 本标准规定了大豆疫霉菌PCR检测的样品制备、检测技术和操作程序。 本标准适用于大豆植物组织及土壤中大豆疫霉菌的分子检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 巢式 PCR(nested PCR) 是指利用两套PCR引物(巢式引物) 对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中， 外引物用以产生扩 增产物， 此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增 多个靶位点的可能性， 增加了检测的敏感性， 又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的特异 性。 3 原理 大豆疫霉菌 (Phytophthorasojae)隶属鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉目， 腐霉科，疫霉属。真核生 物核糖体基因包括5S、5.8S、18S、25S在内的4个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度 重复序列， 由于其进化速率慢， 常用于探讨科级和科级以上等级的分类、检测和鉴定。核糖体基因转录 间隔区(Internal transcribed spacer ITS)是介于18S rDNA、 5.8S rDNA和25S rDNA之间的区域，该 区域进化速率较编码区快，研究表明ITS在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度 保守，可以为病原菌的分子检测提供理想的靶序列。根据大豆疫霉菌ITS的特异序列，合成一对特异性 引物，获得大豆疫霉菌特异性扩增片段，用于大豆疫霉菌的快速分子检测。