DB35T 1593-2016禽坦布苏病毒病诊断技术.docxVIP

1 ICS 11.220 B41 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1593—2016 禽坦布苏病毒病诊断技术 Diagnostic techniques for avian Tembusu virus infection 2016 - 08 - 22 发布 2016 - 11 - 22 实施 福建省质量技术监督局 发 布 I DB35/T 1593-2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、傅秋玲、白泉阳、施少华、程龙飞、陈珍、陈翠腾、 陈红梅、朱春华、刘荣昌。 1 DB35/T 1593-2016 禽坦布苏病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定禽坦布苏病毒病的临床诊断要点和病毒核酸诊断的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的 操作技术规程。 本标准适用于禽坦布苏病毒病的临床诊断和实验室诊断。 2 疫病概述 禽坦布苏病毒病在我国家禽业中，尤其是蛋鸭、种鸭中广泛流行，临床表现以高热、采食量骤降、 产蛋率骤降和种(蛋) 禽卵巢(卵泡) 严重出血或(和) 卵黄液化为特征。该病在我国不同地区、不同 品种鸭群发病率高低不一， 群内发病率几乎为100%， 病死率为0~12%。禽坦布苏病毒除主要侵害不同品 种的种(蛋) 鸭外， 还危害肉鸭(如樱桃谷肉鸭、半番肉鸭等) ，临床上以共济失调、软脚、脑炎和肝 脏局灶性出血为特征。 禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属成员， 为有囊膜病毒， 其基因组为单股正链RNA， 长度约为11 kb，含有一个长度为10 278 bp开放阅读框， 编码含3 425个氨基酸的多聚蛋白， 其各组成蛋白依 次为5’-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。禽坦布苏病毒在遗传进化上与黄病毒科 黄病毒属可经蚊虫传播的病毒遗传进化关系较近， 但禽坦布苏病毒病在冬春寒冷季节蚊虫较少时仍有发 生，可通过直接接触和气溶胶传播，也有禽坦布苏病毒垂直传播的报道。 3 临床诊断 3.1 临床症状 当禽(尤其是种禽、蛋禽)出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一： a) 体温急剧升高，采食量骤降； b) 产蛋率骤降； c) 开产种(蛋) 禽产蛋率上升慢、持续低产蛋率、无产蛋高峰或(和) 产蛋率时高时低(适于种 禽、蛋禽)； d) 后备种(蛋)禽开产推迟或(和)产蛋不整齐； e) 双脚无力、共济失调或(和)双翅下垂。 3.2 剖检病变 当禽(尤其是蛋禽)出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 种(蛋)禽卵巢(卵泡)出血； b) 种(蛋)禽卵泡内卵黄液化，卵泡变形； c) 种(蛋)禽腹腔内积有淡红色血水或淡黄色浑浊液体； d) 种(蛋)禽卵巢(卵泡)萎缩，卵泡数量减少； 2 DB35/T 1593-2016 e) 肉禽肝脏局灶性出血或(和)脑组织轻度出血。 3.3 初步诊断 当禽(包括后备种蛋禽) 出现3.1的临床症状之一或3.2中剖检病变之一时， 可作出初步诊断； 需确 诊，应进行实验室进一步诊断。 4 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断 4.1 样品采集与处理 采集发病禽、濒死禽或死亡禽(尤其是种禽、蛋禽) 的卵巢、肝脏、脑组织样品。将采集的组织经 剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液(PBS，见附录A.1)按照体积比1：4的比例制成组织匀浆液，反复冻融3 次，8 000 rpm离心30 min，取上清冻存分装备用。 4.2 主要仪器设备 主要仪器设备有： a) PCR 仪； b) 高速台式冷冻离心机； c) 微量移液器； d) 组织匀浆器； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像系统。 4.3 试剂 采用的试剂有： a) RNA 提取试剂 Trizol； b) 三氯甲烷； c) 异丙醇； d) 焦炭酸二乙酯(DEPC) 处理水：配制方法见附录 A.2； e) 75%乙醇：配制方法见附录 A.3； f) 溴化乙锭溶液：配制方法见附录 A.4； g) 1×TAE 缓冲液：配制方法见附录 A.5； h) 1.0% 琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A.6； i) DNA 相对分子质量标准物：DL2 000； j) 10×加样缓冲液：配制方法见附录 A.7。 4.4 引物 根据禽坦布苏病毒的非结构蛋白NS5基因保守区特征设计特异性引物，引物序列为，上游引物 F：5’-