碳青霉烯酶OXA-72在毕赤酵母中的表达纯化及其性质研究的开题报告.docxVIP

碳青霉烯酶OXA-72在毕赤酵母中的表达纯化及其性质研究的开题报告 一、研究背景 随着临床应用广谱 β-内酰胺类药物的增多，细菌对这类药物的抗药性也逐渐增强，β-内酰胺酶的广泛存在是导致细菌抗药性增强的一个重要原因。碳青霉烯酶 (carbapenemase) 是一类与 β-内酰胺酶同源的抗生素羟化酶，能够降解所有 β-内酰胺类药物及部分其他抗生素，包括青霉素类药物和头孢菌素类药物等，使其对这些药物失效。其中 OXA-72 是一种烯醇类碳青霉烯酶，目前已在多种细菌中分离出来，如厌氧菌属 (Bacteroides spp.)、埃希氏菌属 (Escherichia coli) 和克雷伯菌属 (Klebsiella pneumoniae) 等，且已经出现了 OXA-72 酶产生菌的临床感染案例。因此，对 OXA-72 酶的研究具有重要的现实意义和医学价值。 二、研究目的 本研究旨在高效地在毕赤酵母菌中表达和纯化 OXA-72 酶，研究其基本性质及对不同抗生素的抗性情况，为进一步研究 OXA-72 酶的生物学特性、结构和功能提供基础数据。 三、研究方法 1. 购买人工合成的 OXA-72 基因，设计引物进行 PCR 扩增，将 OXA-72 基因插入毕赤酵母表达载体 pPICZαA 中。 2. 通过电转化法将重组质粒转化入毕赤酵母菌株中，经 G418 选中筛选得到高效表达 OXA-72 酶的菌株。 3. 利用 BCA 法检测毕赤酵母培养液中 OXA-72 酶的表达量，并选取最适表达条件下的菌株进行酶的纯化。 4. 利用 Ni2+ 柱进行 His6- 标签融合蛋白的亲和层析纯化，再使用 Superdex 200 HR 16/60 色谱进行凝胶过滤纯化。通过 SDS检测纯化后 OXA-72 酶的纯度和分子量。 5. 对纯化后的 OXA-72 酶进行 pH 值、温度、离子强度和金属离子等因素的活性检测，同时对其对不同抗生素的敏感性进行测试。 四、研究意义 1. 深入研究 OXA-72 酶的生物学基础和化学特性，对解决细菌耐药问题有重要的指导作用。 2. 研究 OXA-72 酶对不同抗生素的抗性情况，可为临床诊治提供参考和指导。 3. 基于毕赤酵母表达系统的 OXA-72 酶高效表达和纯化方法，为大规模生产 OXA-72 酶提供技术支持。