DB35T 1353-2013海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程.docxVIP

ICS 65.150 B 51 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1353—2013 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 Diagnostic protocols for Cryptocaryonosis of marine cultured fish 2013-08-01 发布 2013-11-01 实施 福建省 质 量技 术 监 督 局 发 布 I DB35/T 1353—2013 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。 本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、福建省水生动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：樊海平、卓玉琛、林煜、吴斌、马平、曾占壮、钟全福、翁祖桐。 1 DB35/T 1353—2013 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 1 范围 本标准规定了海水养殖鱼类刺激隐核虫病的术语与定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、 形态学及PCR诊断。 本标准适用于海水养殖鱼类刺激隐核虫病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改单) 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 3 术语与定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 刺激隐核虫病 Cryptocaryonosis 俗称海水小瓜虫病，海水养殖鱼类受刺激隐核虫 (Cryptocaryon irritans) 感染，发生病理变化， 出现行为异常或死亡。 4 试剂与仪器 4.1 试剂与溶液 4.1.1 水：GB/T 6682，一级。 4.1.2 海水：压力为 1.05 kg/cm2，121.3 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 4.1.3 生理盐水。 4.1.4 固定液：4％甲醛或 70％乙醇。 4.1.5 引物： ——F1：5-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3，浓度 10 μmol/L，-20 ℃保存； ——R1：5-TGAGAGAATTAATCATAATTTATAT-3，浓度 10 μmol/L，-20 ℃保存。 4.1.6 溶菌酶 ( 100 μg/mL)： 生化试剂，-20 ℃保存。 2 DB35/T 1353—2013 4.1.7 蛋白酶 K ( 100 μg/mL)、 NaCl (3 mol/L)、 裂解缓冲液、SYBR Green Ⅰ工作液按附录 A 的规 定配制。 4.1.8 DNA 分子量标准 (0.1 kb~1.5 kb) ：生化试剂，-20 ℃保存。 4.1.9 阳性对照：刺激隐核虫 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.1.10 阴性对照：未感染刺激隐核虫的海水鱼类 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.1.11 空白对照：无菌双蒸水为模板。 4.1.12 Giemsa 染色液：Giemsa 干粉 1 g，甘油 (分析纯) 66 mL，甲醇 (分析纯) 66 mL。将 Giemsa 干粉倒入研钵内，加少量甘油，研磨至无颗粒状，将剩余甘油倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中， 56 ℃温箱中保温 2 h，再加入甲醇混匀后贮存备用。 4.1.13 甘油 (分析纯) 。 4.1.14 除上述试剂与溶液外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 5 章的规定执行。 4.2 仪器与设备 4.2.1 光学显微镜、解剖镜和放大镜 (30 × )。 4.2.2 PCR 扩增仪：配备 25 μL 和 50 μL 的 PCR 反应底座。 4.2.3 凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。 4.2.4 电泳仪：输出直流电压 0 V~400 V，直流电流 1 mA~500 mA。 4.2.5 水平电泳槽：容量 250 mL~650 mL，带凝胶板、样孔梳。 4.2.6 台式离心机：配备 1.5 mL 转子，转速 16 000 r/min 以上。 4.2.7 电动研磨器：转速 500 r/min~5 000 r/min。 4.2.8 研磨棒：1.05 kg/cm2 、121.3 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 4.2.9 离心管：1.5 mL，1.05 kg/cm2 、